聚合酶链反应对菌阳肺结核治疗的监测
中华结核和呼吸感染 1998年第7期第21卷 论 著
作者：安素芳 樊玉华
单位：510095 广州，广州市胸科医院内科
关键词： 聚合酶链反应；结核，肺；分支杆菌，结核；药物疗法
【摘要】 目的 探讨痰菌阳性肺结核患者在治疗期及停药2年内痰结核分支杆菌及其DNA阴转情况与复发的关系以及聚合酶链反应(PCR)对菌阳肺结核患者治疗的监测价值。方法 用PCR技术、涂片及培养法对87例菌阳肺结核于治疗期每月检测1次，停药期继续随访2年。结果 痰结核分支杆菌PCR转阴时间通常比涂片和培养迟1～3个月，痰含菌量越多，PCR持续阳性时间越长。87例中10例(11%)PCR持续阳性1年以上，其中3例(30%)分别于停药后8、12、16个月时复发，1例PCR已转阴病例于18个月时复发。此4例均有痰菌复阳，胸片示病灶增多而再次接受治疗。结论 PCR用于临床疗效观察比涂片、培养实用，对估计有可能复发的病例有一定帮助。
Polymerase chain reaction technique in monitoring treatment of bacillary pulmonary tuberculosis
An Sufang, Fan Yuhua. Guangzhou Hospital of Thorax, Guangzhou 510095
【Abstract】 Objective To explore the relationship between sputum Mycobacterium tuberculosis as well as its DNA negative conversion and relapse in bacillary pulmonary tuberculosis during chemotherapy and 2 years after completion of treatment, and to evaluate the value of polymerase chain reaction (PCR) technique in monitoring the efficacy of treatment.Method Eighty-seven patients with bacillary pulmonary tuberculosis were monthly examined by PCR technique, smear and culture methods, and were followed up for 2 years after treatment.Result The duration of sputum negative conversion by PCR technique was 1～3 months later than that by smear and culture methods. The more the sputum bacteria, the longer the duration of PCR positive results. Positive PCR results maintained in 10 out of 87 patients for more than 1 year, among them 3 (30%) relapsed respectively at 8, 12 and 16 months after treatment. One PCR negative conversion case relapsed at 18 months after treatment. These 4 cases who regained sputum positive results and showed deterioration in chest X-ray films were admitted to hospital again.Conclusion PCR technique is more practical than smear and culture methods in monitoring efficacy of the treatment of bacillary pulmonary tuberculosis, and is useful for evaluating cases with possible relapse.
【Key words】 Polymerase chain reaction Tuberculosis, pulmonary Mycobacterium tuberculosis Drug therapy
从分子水平诊断结核病是结核病发展史上第三个里程碑。由于聚合酶链反应(PCR)具有快速、敏感及96%的特异性［1］，已为临床广泛应用，亦有大量报道。我们侧重讨论PCR应用在肺结核治疗上的临床意义。
对象与方法
1.选择对象：87例均为本院住院患者。初治68例，复治19例，年龄19～80岁；男54例，女33例。痰涂片或培养或两者均阳性。Ⅱ型肺结核1例，Ⅲ型肺结核74例，Ⅳ型肺结核11例，支气管内膜结核1例，有空洞者69例。经抗结核治疗症状改善，痰菌阴转(菌阴标准：涂片连续6次阴性及培养连续2～3次阴性)，胸片示肺部病灶减少或吸收。
2.方法：病例分2组。初治组68例，予6～9个月方案［2HRZS(E)/4HR，2HRZS(E)/7HR］治疗。复治组19例，予一或二线药物治疗(视个体选用药物)，时间为9～12个月。
收集各组患者清晨痰，分别进行PCR、涂片、培养检查。痰涂片每日1次，连续3～6日，萋-尼染色镜检；使用Johmston实验公司的BACTEC 460结核自动检测系统分离培养结核分支杆菌；PCR检测使用美国PE-480型DNA循环仪及华美生物工程公司提供的试剂盒，其检测过程严格按华美生物工程公司提供的试剂盒规定方法进行，同时做抑制试验进行对照，以减少假阳性、假阴性。治疗期每月检测1次，治疗期满停药，每3～6个月复检1次，随访2年。
结果
治疗前，初治组68例PCR阳性率为87%(59/68)，复治组19例PCR阳性率为84%(16/19)，总阳性率为86%(75/87，表1)。其中8例于治疗前为假阴性，治疗1～2个月后转阳，另4例于治疗前后PCR一直阴性。
表1 87例治疗前PCR检查结果
| 组别 |
例数 |
阳性例数 |
阳性率(%) |
| 初治 |
68 |
59(5) |
87 |
| 涂阳培阳 |
50 |
47(3) |
94 |
| 涂阳培阴 |
6 |
3 |
50 |
| 涂阴培阳 |
12 |
9(2) |
75 |
| 复治 |
19 |
16(3) |
84 |
| 涂阳培阳 |
16 |
14(2) |
88 |
| 涂阳培阴 |
1 |
1 |
100 |
| 涂阴培阳 |
2 |
1(1) |
50 |
注：括号内数字为治疗后PCR转阳例数 初治组68例中，6个月化疗59例，9个月化疗9例。治疗1～4个月痰菌转阴100%，而PCR转阴41例(60%)，持续阳性1年以上7例(10%)。复治组19例，痰菌1～4个月内转阴13例(68%)，PCR转阴12例(63%)。持续阳性1年以上3例(16%)。PCR持续阳性时间比涂片和培养长1～3个月(表2)。
表2 87例治疗后涂片、培养、PCR转阴例数
| 组别 |
例数 |
转阴时间(月) |
| 1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
| 初治涂阳培阳 |
50 |
13 |
18 |
15 |
4 |
| PCR(+)* |
50 |
3 |
9 |
6 |
13 |
5 |
6 |
1 |
| 初治涂阳培阴 |
6 |
5 |
1 |
| PCR(+) |
3 |
|
1 |
2 |
| 初治涂阴培阳 |
12 |
9 |
1 |
2 |
| PCR(+) |
11 |
3 |
1 |
1 |
2 |
|
1 |
|
|
|
1 |
1 |
1 |
| 复治涂阳培阳 |
16 |
1 |
7 |
2 |
|
1 |
3 |
1 |
1 |
| PCR(+)△ |
16 |
1 |
2 |
3 |
3 |
2 |
|
1 |
1 |
| 复治涂阳培阴 |
1 |
1 |
| PCR(+) |
1 |
1 |
| 复治涂阴培阳 |
2 |
|
2 |
| PCR(+) |
2 |
|
1 |
1 |
注：*7例持续阳性，△3例持续阳性 10例PCR持续阳性者，均为涂阳培阳患者，初治者7例，复治者3例(2例第2次复发)。男5例，女5例，年龄25～70岁。停药6个月时复查，初治组1例PCR转阴，未见复发病例；8个月时1例PCR转阴，但1例经6个月化疗初治患者复发；12、16个月时又有2例PCR结核分支杆菌阳性；18个月时，1例PCR已转阴的经6个月化疗的初治患者复发。以上复发的4例均有痰涂片复阳，胸片示：病灶增多。总复发率为5%。24个月时仍有2例PCR持续阳性，但无临床复发征象，余2例因故未继续随访。
讨论
本研究结果显示，初治组化疗4个月时痰菌转阴率100%，PCR转阴率才60%(41/68)。说明大部分痰标本PCR持续阳性时间比涂片、培养法长，本结果为1～3个月。英国Kennedy等［2］报道为1～2个月，Yuen等［3］报道为1个月。以前的研究把其归属为非存活的、不具有抗酸性的杆菌连续排出，包括不能培养的休眠菌或经碱去污后使抗酸杆菌变异，失去抗酸性和活力，导致培养时呈阴性结果。问题是抗结核药物的治疗作用，在某些病例可能仅仅是部分有效，而结核病的治疗，同样依赖于宿主防御机制和合理有效的抗结核药物。肺部严重受损时，可能发生排出的结核分支杆菌不足以使疾病继续发展，但又不能继续繁殖。这是因为药物在损坏的肺内穿透力较强，但宿主的免疫细胞清除力受损，造成杀灭细菌能力下降，故痰检PCR可长期持续阳性［3］。另一学说认为，由于多种因素的影响，致使结核分支杆菌L型产生。庄玉辉等［4］报告77例结核分支杆菌培养阴性的肺结核L型菌阳性率为18%；金关甫等［5］报告68例菌阴肺结核L型菌检出率为29%。这种变异菌生物学特征是：细胞壁部分或全部缺失，缺乏结核分支杆菌染色呈抗酸性物质——分枝菌酸；失去原菌的形态；抗酸染色呈阴性；在结核分支杆菌培养基上不能生长，毒力减弱，对药物敏感性差，抗原性有改变，趋化作用与变态反应减弱。所以L型结核分支杆菌是一种主要的耐药菌，并能逃脱机体免疫功能的攻击［6］。复治组PCR检测与细菌学检查阳性持续时间相近，如：化疗4个月时，细菌转阴率68%(13/19)，PCR为63%(12/19)。也许与耐药菌株存在、化疗方案的改变及治疗期限延长、本身机体状况等综合因素有关。表1中所见涂阳培阳病例，PCR阳性率为100%，单纯涂阳或培阳病例PCR阳性率为81%(17/21)。说明痰菌含量与PCR阳性率成正比，含菌越多，PCR阳性持续时间越长。PCR一直阴性的4例，均为初治，非涂阳培阳组。出现的假阴性考虑与痰中含菌量少且分布不均匀、结核分支杆菌菌壁坚固、DNA提取不完全或DNA损失、抑制物长期存在等因素有关。87例中，有10例PCR持续阳性1年以上，3例分别于停药后8、12、16个月时肺结核复发，2例是初治，1例是复治。均合并有慢性呼吸道疾病或糖尿病酮症酸中毒，肺内有空洞存在。复发率30%(3/10)，低于陈苏民等［7］的结果——初治组PCR持续阳性6例，复发1例，复治组持续阳性10例，复发5例。与Yuen等［3］研究所得相似——7例伴有其他机体疾病、PCR持续阳性，2例(29%)分别于停药9个月、11个月时肺结核复发。他们认为肺结核，同时伴有使机体免疫功能降低的疾病，如：糖尿病、酒精性肝病、恶性肿瘤、AIDS、硅肺、海洛因成瘾、强直性脊椎炎、慢性阻塞性气道疾病、类固醇治疗等，则PCR持续阳性可能性大，复发的可能性亦大。本文中总结的10例PCR持续阳性1年以上者亦是同时或以前已存在其他机体疾病。Hellyer等［8］报告，23例菌阳患者中，5例痰标本PCR持续阳性1年以上，就有2例接受过皮质类固醇治疗，1例是糖尿病患者，痰中有耐药菌株。本文另1例肺结核复发者，是予短程化疗同时合并糖尿病中年女性，原PCR已转阴，于停药18个月时，因糖尿病恶化痰菌复阳，肺部病灶增多而复治。说明PCR转阴者，肺结核亦有可能复发。另2例PCR持续阳性2年以上而无临床复发，可能由于强力化疗期满停药后，残存肺内无活性的变异菌或休眠菌，与机体免疫力处于长期相互抗衡状态，并间断少量排出，但在某个时候，残存的细菌可能会死灰复燃。其演变过程，尚待进一步探讨。
随着有效抗结核药物的使用，化疗方案以保证顺应性、降低药物毒性及费用为目的而不断得以改进。从18个月的治疗期减少到4个月。利用细菌学检查观察疗效，则敏感性低，获得时间长。PCR特异性相对较低，但其敏感、快速的优点对临床医师则帮助较大，是监测肺结核疗效的一种有发展前途的方法［2］。因为结核分支杆菌L型是形成慢性传染源的主要原因，也是结核病恶化、复发的细菌学根源［6］。所以对年老体弱、合并有其它机体疾病、痰中含菌量多、肺部结核病变广泛、有空洞存在、化疗期满、微生物学检查(涂片加培养)阴转但PCR仍持续阳性的患者，采取继续密切观察，或同时考虑更改治疗方案或延长治疗时间及随访时间等做法，是否能减少复发率及传染源，有待今后继续探讨。
参考文献
1 Kocagoz T, Yilmaz E, Ozkara S, et al. Detection of Mycobacterium tuberculosis in sputum samples by polymerase chain reaction using a simplified procedure. J Clin Microbiology, 1993, 31:1435-1438.
2 Kennedy N, Gillespie SH, Saruni AOS, et al. Polymerase chain reaction for assessing treatment response in patients with pulmonary tuberculosis. J Infect Dis, 1994, 170:713-716.
3 Yuen KY, Chan KS, Chan CM, et al. Monitoring the therapy of pulmonary tuberculosis by nested polymerase chain reaction assay. J Infect, 1997, 34:29-33.
4 庄玉辉，李国利，张晓刚. 抗酸菌L型(变异)分离培养方法的研究.微生物学通报，1991，6：348.
5 金关甫，庄玉辉，刘金伟，等. 痰结核分枝杆菌阴性L型菌阳性肺结核的临床观察.中国防痨杂志，1991，13：114.
6 张敦.结核菌L型的临床与流行病学意义. 中华结核和呼吸杂志，1993，16：181-183.
7 陈苏民，冯金华，陈景芳，等. 聚合酶链反应在肺结核疗效检测中的临床意义. 青岛医学院学报，1996，36：156.
8 Hellyer TJ, Fletcher TW, Bates JH, et al. Strand displacement amplification and the polymerase chain reaction for monitoring response to treatment in patients with pulmonary tuberculosis. J Infect Dis, 1996, 173:934-941.
(收稿：1997-12-08 修回：1998-02-24)
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