睡眠剥夺对大鼠学习和行为的影响
第四军医大学学报2000年第21卷第6期
宋国萍 苗丹民 皇甫恩 陈足怀 冯学文
摘 要: 目的 研究不同时间的睡眠剥夺（SD）及部分睡眠剥夺（PSD）对大鼠行为和学习的影响.方法 采用小平台水环境法建立SD模型，以正常饲养组（CC）和大平台组（TC）作为对照，SD组有12, 24, 48, 72, 96 h及PSD，每组例数为6只，CC组为5只. 测量SD后动物学会Y型迷宫的总次数、时间、条件反射数和正确反应率，用旷场反应测量行为并观察SD前后体质量的变化.结果 TC组学习成绩、正确反应率优于其他各组，24 h和48 h SD组学习成绩优于CC，其他各组学习成绩不如CC，随SD时间的延长，正确反应率下降. 同CC和TC相比，SD组动物行为增加，情绪敏感，以24 h和48 h最为突出. 96 h后SD组及PSD组体质量明显下降.结论 SD使动物体质量减轻，行为兴奋性提高，但48 h后兴奋性降低，学习能力下降.
关键词：睡眠剥夺；学习；行为；大鼠
0 引言
睡眠不仅具有维持个体生存的功能，还有促进生长发育、易化学习、形成记忆的功能. 睡眠剥夺（sleep deprivation，SD）可引起情绪、学习记忆、免疫功能等一系列改变［1］. 实验证明，睡眠对随后的学习非常重要，预先睡眠剥夺48 h后，学习能力下降［2］. 而且睡眠对于学习复杂事物的固化是非常必要的，对于简单事物则非必需. 在生活节奏日益加快的今天，SD发生率明显升高. 在国外是心理学家、生理学家以及特殊职业研究者和军事研究机构的研究热点，而我国在此方面的研究尚少. 有关SD的研究可以揭示睡眠的意义，从而提出相应的对抗措施，提高工作效率. 我们采用小平台水环境法对大鼠进行SD，观察SD前后体质量变化，以旷场试验、Y迷宫为主要工具，研究不同时间长度的SD及PSD对大鼠情绪和学习能力的影响，探讨睡眠与情绪及学习的关系.
1 材料和方法
1．1 实验动物及分组 成年、雄性、健康上海产SD大鼠50只，体质量（180±5）g（本校实验动物研究中心提供）. 剔除对电击不敏感的大鼠3只. 将余下47只大鼠随机分为8组，每组6只，其中SD分别为12，24，48，72和96 h组，PSD组即每天仅允许睡眠6 h，共96 h，正常单独饲养组(normal cage, CC)和大平台实验对照组(tank control,TC)，其中CC组为5只外，其余每组均6只.
1.2 动物模型的制备 采用小平台水环境法（flower pot technique）［3，4］建立大鼠SD模型. 我们按文献［3，4］，制作30 cm×30 cm×30 cm的鼠箱，其中有一直径为6.3 cm，高8.0 cm的平台，在平台周边注满水，水温保持在20℃左右，水面距平台面约1.0 cm. 鼠在平台上可自行饮食饮水. 若其睡眠，则由于肌肉张力松弛而落入水中. 在大鼠活动空间内持续40 W日光灯照射，室内温度控制在18.0～22.0℃. TC组的实验设备与此相仿，只是平台直径为18.0 cm，可使鼠有一定的活动空间. 每天更换鼠箱中的水. 实验前，让鼠熟悉适应环境1 wk.
1．3 行为实验装置 Y-迷宫［5］由本校预防医学系防原教研室提供：为三个互相连通的等分Y型辐射式迷宫. 旷场试验（open field test，OFT）箱由本教研室根据文献［6］制作：高40 cm，直径80 cm，周壁为黑色，底面由面积相等的25块方格组成的旷场.
1．4 行为实验程序
1．4．1 学习能力 Y迷宫每臂顶端设一个信号灯，以此提示“危险区”，信号灯亮后6 s，此臂即为危险区，通以36 V交流电，刺激大鼠在通电后从所在的亮臂跑到暗臂. 训练中始终有一臂为安全区，安全区以无规则的次序变换. 实验在安静的、光线较暗的环境中进行，实验时，将大鼠放入迷宫中，先使其适应5 min，然后开始实验. 如果大鼠在通电后从所在的亮臂跑到另一亮臂记为错误一次；如果在灯亮后不进入暗臂直到通电后方进入暗臂记正确一次；如果在灯亮后通电前跑到暗臂记条件反射一次. 大鼠连续15次训练正确时，即认为达标.
记录大鼠达标时所需的总训练次数为学习成绩（learning score，LS），并同时记录了所需的时间（learning time，tL）；记录达标时条件反射形成的次数（condition reflex number, CN）；记录达标时正确反应的次数在总训练次数中的比率（percentage of right reflex, PR）.
1．4．2 行为测定 将鼠置于旷场反应箱中，观察3 min的行为，以穿越底面的方格数为水平运动得分（crossing），以后肢直立的次数为垂直活动得分（rearing），两者总和为旷场试验得分，并观察动物修饰行为和大小便次数，每只动物仅做一次行为测定. 每次试验后，清洗旷场周壁及底面，以免上次动物余留的信息影响下次测试结果.
1．5 数据处理 取每组各只大鼠的平均值，实验数据采用SPSS软件包进行t检验、单因素方差分析和Neuman-Keuls检验.
2 结果
2．1 SD后大鼠学习的结果 实验后将各组Y-迷宫LS,tL,CN,PR得分同CC组和TC组进行比较，结果如Tab 1所示.
TC组学习成绩优于其他各组（P＜0.05），SD24 h和SD48 h 组学习成绩优于CC（P＜0.05），SD12 h同CC组相比无明显差异，SD72 h,SD96 h和PSD学习成绩不如CC（P＜0.05）；正确反应的比率TC组优于其他组（P＜0.05），随SD时间的延长，正确反应的比率有下降的趋势，同CC组相比，SD72 h,SD96 h组差异显著（P＜0.05）.
表 1 睡眠剥夺(SD)后大鼠学习结果
Tab 1 Learning results of rats after SD(X±s)
| Group |
n |
LS |
tL/s |
CN |
PR(%） |
| SD12 h |
6 |
75.7±10.1a |
353.2±26.8 a |
24.1±9.0a |
52.4±3.8a |
| SD24 h |
6 |
54.9±8.5ab |
274.6±19.6ab |
19.3±6.1a |
53.9±6.1a |
| SD48 h |
6 |
52.8±7.2ab |
266.3±24.4 ab |
16.8±4.4 |
50.1±5.0a |
| SD72 h |
6 |
96.5±6.9a |
421.0±37.6ab |
31.2±5.1a |
43.9±3.7ab |
| SD96 h |
6 |
112.1±7.1a |
506.2±33.1ab |
33.5±8.0a |
37.2±4.2ab |
| PSD |
6 |
89.3±6.3a |
498.2±43.1a |
27.5±4.7a |
50.4±4.0a |
| CC |
5 |
70.2±9.6a |
342.2±62.3a |
22.7±8.0a |
54.2±4.3a |
| TC |
6 |
45.6±4.8 |
225.4±18.2 |
14.3±4.0 |
73.1±3.8 |
sD: sleep deprivation; PSD: partial sleep deprivation; CC: normal control; TC: tank control; LS: learning score; tL: learning time; CN: condition reflex number; PR: Percentage of right learning. aP＜0.05 vs TC;bP＜0.056 vs CC.2.2 SD后大鼠旷场试验结果 各组实验后在旷场反应箱中测试行为，结果如Tab 2所示.
Tab 2显示，SD组大鼠行为增多，修饰行为增多，对于给它的刺激敏感、易怒，实验后将它放入饲养笼中，对其他鼠进攻行为增多，PSD组较其他SD组进攻行为要少，较温和. TC组总得分高于正常组（P＜0.05），TC组修饰行为次数同正常组相比相差不显著；SD各组及PSD组的总得分、修饰行为次数高于正常对照组（P＜0.01）， SD24 h和SD48 h组的总得分、修饰行为次数又高于SD12 h,SD72 h和SD96 h及PSD组（P＜0.05）；SD24 h,SD48 h和SD72 h组的总得分和修饰行为高于TC组（P＜0.05）.
表 2 SD后大鼠旷场试验得分
Tab 2 Open-field results of rats after SD(X±s)
| Group |
n |
Total Score |
Number of
Make-up |
Number of
excrete |
| SD12 h |
6 |
24.7±7.1b |
8.9±1.7ab |
1.0±0.4 |
| SD24 h |
6 |
46.0±11.0ab |
10.3±2.2ab |
0.9±0.3 |
| SD48 h |
6 |
42.0±9.6ab |
11.1±1.2ab |
0.5±0.5 |
| SD72 h |
6 |
32.7±6.3ab |
7.6±0.9ab |
1.2±0.5 |
| SD96 h |
6 |
22.9±5.1b |
8.0±0.9ab |
1.0±0.0 |
| PSD |
6 |
25.8±8.4b |
6.8±1.0ab |
0.8±0.6 |
| CC |
5 |
11.7±4.8a |
4.8±0.2 |
0.4±0.2 |
| TC |
6 |
18.5±3.2b |
4.9±1.5 |
0.9±0.8 |
sD,PSD,CC,TC: The same as in Tab1. aP＜0.05 vs TC;bP＜0.01 vs CC.2.3 SD前后大鼠体质量的变化 测量大鼠SD前和实验96 h后测量体质量的变化(Tab 3).
表 3 SD前后大鼠体质量的变化
Tab 3 Body mass of rats before & after SD (X±s，g)
| Group |
n |
Starting |
Ending |
| SD96 h |
6 |
178.0±4.0 |
163.4±3.6b |
| PSD |
6 |
181.0±4.0 |
172.1±2.8a |
| CC |
5 |
178.0±3.0 |
196.7±2.3a |
| TC |
6 |
180.0±4.0 |
177.3±3.1 |
sD,PSD,CC,TC:The same as in Tab1. aP＜0.05,bP＜0.01. 96 h后，SD组同CC 及TC组相比体质量明显下降P＜0.01，PSD组体质量也有所下降(P＜0.05)，正常饲养组体质量增加(P＜0.01)，TC组体质量无明显的变化.
3 讨论
SD是研究睡眠的重要方法，本研究采用小平台水环境法进行SD，水环境对大鼠有一定的兴奋作用，一定程度的隔离和限制活动也会产生应激. 为了排除隔离、限制活动和水环境造成的应激的影响，除采用CC组作为对照外，还采用了TC组作为对照. TC组平台增大，其他条件与小平台相同，排除了小平台对大鼠活动限制的应激. 已有研究［7］表明，平台面积与大鼠体质量之比为1∶1时不会产生SD，故本研究中大平台直径为18.0 cm. 在实验前后TC组体质量无明显变化，说明其应激水平远远低于SD组. 水环境和隔离对动物确实产生一定的应激作用，这从旷场实验得分及Y迷宫学习成绩可知. 尽管多个平台可以消除大鼠活动限制所致的应激，但Medeiros［8］的研究证实多个平台剥夺睡眠的方法会产生其他应激，用脑电图做检测，显示不如单一平台法优越，故本实验采用单一平台.
由旷场实验得知，与正常对照组和TC组相比，大鼠SD后精神行为表现出一定的兴奋性，修饰行为或“洗脸”行为增多，我们知道修饰行为常发生于产生矛盾或害怕的情境中［9］，说明SD环境使大鼠情绪非常紧张恐惧，攻击行为增多. SD后24 h和48 h组最为活跃，12,72和96 h组兴奋性较弱，说明若SD时间短，表现为一定的抑制，72 h以后则有抑制趋势. PSD组，即96 h内仅睡眠24 h，也表现出一定的兴奋性，但要高于SD96 h组，修饰行为则要少于SD96 h组，说明PSD后动物的兴奋性要高于持续SD，但情绪要比持续SD者缓和. 这同以往的报道一致，如：在Youngblood等［7］的研究中48和72 h睡眠剥夺后游泳行为增加.
TC组由于一定的应激作用，兴奋性较高，并且没有SD的影响，所以学习成绩优于其他各组. 由于大鼠SD后兴奋性的提高，SD24 h 和SD48 h 组的Y迷宫学习成绩优于对照组，其他各组表明了SD对学习的影响. 随着SD时间的延长，剥夺程度加深，对学习的影响便更加明显，正确反应率下降. PSD也显示出学习能力的下降. Albert的研究表明，SD不影响主动回避反应的学习，可能同他采用反转技术（rotating platform technique）SD有关，并且已有人［10］指出SD 11 d后用小平台水环境法，大鼠脑内不同区域胺类物质无变化，而采用反转技术的大鼠有变化.
由以上分析得，SD使动物体质量减轻，初期行为兴奋性提高，后期兴奋性降低，使学习能力下降. SD后学习的效应是SD和一定应激的共同作用.
基金项目：全军“九五”卫生医药基金资助项目（96L050）
作者简介：宋国萍(1972-)，女(汉族)，河北省石家庄市人. 硕士生(导师皇甫恩). Tel.(029)3374816 Ext.416 Email.psych@fmmu.edu.cn
宋国萍（第四军医大学航空航天医学系心理学教研室，陕西 西安，710033）
苗丹民（第四军医大学航空航天医学系心理学教研室，陕西 西安，710033）
皇甫恩（第四军医大学航空航天医学系心理学教研室，陕西 西安，710033）
陈足怀（第四军医大学航空航天医学系心理学教研室，陕西 西安，710033）
冯学文（第四军医大学航空航天医学系心理学教研室，陕西 西安，710033）
参考文献:
［1］ Bueno OFA, Lobo LL, Olivedra MGM et al. Dissociated paradoxical sleep deprivation effects on inhibiting avoidance and conditioned fear［J］. Physiol Behav, 1994;56(4):775-779.
［2］ Gruart MA, Nadal AR, Coll AM et al. Effects of pretraining paradoxical sleep deprivation upon two-way active avoidance［J］. Behav Brain Res, 1995;72(1-2):181-183.
［3］ Mendelson WB, Guthrie RD, Frederick G et al. The flowerpot technique of rapid eye movement (REM) sleep deprivation［J］. Pharmacal Biochem Behav, 1974;2(3):553-556.
［4］ Bradley DY, Zhou Jun, Smagin GN et al. Sleep deprivation by the “Flower Pot” technique and spatial reference memory［J］. Physiol Behav, 1997;61(2):249-256.
［5］ 李 静，吴彦卓，郭 鹞 et al. 电磁脉冲对大鼠学习记忆的影响［J］. 第四军医大学学报，1999;20（1）： 74-75.
［6］ Vecsi L. Effects of cyteamine and pantethin on open-field behavior hypothalamic cate cholarmine concentrations, and somatostatin-induced barrel retation in rats［J］. Pharmacal Biochem Behav, 1989;32(3): 629-635.
［7］ Youngblood BD, Zhou J, Smagin GN et al. Sleep deprivation by the Flower Pot technique and spatial reference memory［J］. Physiol Behav, 1997;61(2):249-256.
［8］ Medeiros R, Lenneberg HC, Hoshino K et al. Neuroethologic differences in sleep deprivation induced by the single-and multiple-platform methods［J］. Braz J Med Biol Res, 1998;31(5): 675-680.
［9］ Brady KJ, Brown JW,Thurmond JB. Behavioral and neurochemical effects of dietary tyrosine in young and aged mice following cold-swim stress［J］. Pharmacal Biochem Behav, 1979;12(5):667-672.
［10］ Tsai LL,Bergman BM,Perry BD et al. Effects of chronic total sleep deprivation on central noradrenergic receptors in rat brain［J］. Brain Res, 1993;602(2):221-227.
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