补肾益智方阻抑老年性痴呆大鼠海马突触病理性重构的研究

广州中医药大学学报 2000年第2期第17卷 老年性痴呆防治研究

作者：胡镜清　赖世隆　王奇　梁伟雄　谢红　郑高飞

单位：胡镜清　赖世隆　王奇　梁伟雄　谢红（广州中医药大学老年脑病研究所，广州　510405）；郑高飞（广州中医药大学电镜室，广州　510405）

关键词：阿尔茨海默病；中药疗法；痴呆；老年性；中药疗法；补肾药；治疗应用；@补肾益智方；药理学；突触；药物作用；疾病模型；动物；大鼠

　　摘要：应用体视学定量分析方法，观察补肾益智方(由蛇床子、枸杞子、女贞子、人参、首乌等组成)对D-半乳糖致亚急性衰老合并Meynert核损毁的老年性痴呆(又称阿尔茨海默病，Alzheimer's disease, AD)模型大鼠海马齿状回分子层突触病理性重构的影响。结果显示，补肾益智方灌胃组大鼠突触数密度较AD模型组明显增加(P＜0.01)、面密度和平均面积显著减少(P＜0.01)，而与正常对照组比较无明显差异(P＞0.05)，表明该方具有阻止AD模型大鼠海马突触病理性重构的作用，提示对突触可塑性的影响可能是该方改善学习记忆的神经生物学机制之一。

　　中图分类号：R749.1⁺6　　　文献标识码：A

　　文章编号：1007-3213(2000)02-0113-04

　　脑内突触结构和功能的可塑性(synaptic plasticity)已被证实是学习记忆的神经生物学机制，同时，突触的病理性重构也是老年性痴呆(又称阿尔茨海默病，Alzheimer's disease，AD)病理进展过程中非常重要的环节，是AD患者学习记忆能力下降的病理基础之一。我们前期的研究工作表明，补肾益智方能够保护D-半乳糖致亚急性衰老合并脑Meynert基底核损毁AD模型大鼠的学习记忆能力和脑内胆碱能系统^［1］。为了解补肾益智方改善学习记忆可能的突触可塑性作用机制，我们应用体视学方法对海马齿状回中分子层突触超微结构进行定量分析，观察了该方对D-半乳糖致亚急性衰老合并脑Meynert基底核损毁AD模型大鼠突触病理性重构的影响。

　　1　材料与方法

　　1.1　药物与试剂

　　补肾益智方由蛇床子、枸杞子、女贞子、人参等组成，制成浓缩液。双益平片，上海红旗制药厂生产(批号为970101)，每片含石杉碱甲(Huperzine-A)0.05mg。D-半乳糖，上海试剂二厂出产；鹅膏蕈氨酸(ibotenic acid, IBO),Sigma公司提供，均为分析纯。

　　1.2　动物分组、造模与给药

　　15月龄初老年雌性Wistar大鼠20只，体重300～450g，均由第一军医大学实验动物中心提供。常规分笼饲养，自然照明，随意饮水和取食。随机分成4组，每组5只：正常对照组(简称正常组)，腹腔注射生理盐水6周及脑内Meynert核注射生理盐水作为对照；AD模型组(简称模型组)，腹腔注射D-半乳糖(48mg·kg^-1.d^-1)6周和脑内双侧Meynert核注射IBO；双益平片观察组(简称双益平组)和补肾益智方观察组(简称补肾方组)，造模均同模型组，但在腹腔注射半乳糖(6周)同时分别连续给予双益平片(0.3mg·kg^-1.d^-1)或补肾益智方浓缩液(相当生药量60g·kg^-1.d^-1)灌胃。脑内注射在腹腔注射后参考有关文献进行^［1］。

　　1.3　标本制备及观察

　　所有大鼠在脑内注射结束后1周，麻醉，开胸，以4%多聚甲醛(加2.5%戊二醛)经左心室灌流，取脑海马组织，振动半薄切片，1%锇酸后固定，系列酒精脱水，丙酮脱水，平板包埋，定位取齿状回中分子层，AO超薄切片机超薄切片，片厚60nm，将切片捞取至300目铜网上，经柠檬酸铅5～6min、醋酸铀20min双重电子染色后，JEM-1200EX透射电镜观察照相，每例大鼠观察3张铜网，每张铜网由左上角至右下角斜线上下移动，连续拍摄2～3张照片，底片放大1.5万倍，印相，进行体视学分析。

　　1.4　体视学定量分析

　　用绘有0.3cm×0.3cm标准测试方格的透明胶片覆盖于照片上(照片面积为11.2cm×7.7cm)，计算突触的数量和突触连接带与测试线的交点数，代入下列公式中计算出突触的数密度(N_V)、面密度(S_V)和平均面积(S)：N_V=N_A/(l/K₀+d)。

　　N_V为突触的数密度(numerical density)，即单位参照系体积中突触的数目，单位为个/μm³。N_A为突触的面数密度，即单位参照系面积中突触的数目(numerical density area)，单位为个/μm²。l是突触连接带的平均长度(μm)，可由公式l=l_A/N_A；l_A=π/2·Ni/l_T计算得到，Ni为突触连接带与测试线的交叉点数，l_T为测试线的总长度，d为超薄切片的厚度，K₀=1+3d/2l为校正系数，校正因Holmes's效应引起的对突触连接带长度的过高估计。S_V为突触的面密度，为单位参照系体积中的突触面积，单位为μm²/μm³。可由公式S_V=2Ni/(l_T·K₀)计算得出。突触连接带的平均面积S=S_V/N_V，单位为μm²。

　　1.5　统计方法

　　应用SAS6.12统计软件包分析，多组比较及组间两两比较分别采用 F检验和q检验，显著性水平取α=0.05。

　　2　结果

　　在齿状回分子层，来自基底前脑的传入纤维主要与颗粒细胞的树突及树突棘形成轴—树和轴—棘突触。图1-a显示神经毡区的膜性结构，包括突触前后终末及其内部结构，如突触间隙(synaptic cleft)、突触小泡(synaptic vesicle)和增厚的突触前后膜特化带(synaptic pre_or post_active zone)。在我们的观察中，以 GrayI 型突触(兴奋性)为多见，其结构特征表现为较宽的裂隙、不对称的致密物和球形突触小泡。正常组和补肾方组突触密度明显高于模型组，还可见到穿孔性突触(perforated synapse，见图1-b、图1-e、图1-f)。

　　表1为各组大鼠齿状回中分子层突触结构和数量体视学分析结果。经过统计学处理，结果表明：各组之间的突触数密度、面密度和平均面积均存在显著性的差异(P＜0.01)。组间两两比较显示，与正常组比较，模型组突触数密度下降，面密度和平均面积显著增加(图1-c)，均具统计学意义(均P＜0.01)。补肾方组的突触数密度较模型组显著增加，面密度和平均面积显著减少(图1-e,f)，差异均具统计学意义(均P＜0.01))；与双益平组(图1-d)比较，突触数密度增加和面密度、平均面积的减少亦有显著意义(P＜0.05，P＜0.01)；与正常组比较，各观察参数差异均无显著性(P＞0.05)。

表1　各组大鼠齿状回中分子层突触定量分析结果(±s)

　　▲▲与正常组比较，P＜0.01；△△与模型组比较，P＜0.01；*与双益平组比较P＜0.05，**P＜0.013　讨论

　　突触(synapse)作为神经系统的特征性组织结构之一，是完成脑功能非常重要的环节。许多研究证明了学习记忆与突触的数目、类型和结构之间的密切联系。例如有研究发现老年记忆力衰退大鼠的海马齿状回穿孔性突触显著减少，海马结构突触素免疫反应产物灰度较青年组和老年记忆正常对照组明显降低^［2，3］。章子贵等^［4］对记忆保持良好和低劣组小鼠海马CA3区GrayⅠ型突触界面结构进行了定量观察，发现记忆保持良好组海马CA3区突触后膜致密物质(post-synaptic density,PSD)显著地密于记忆保持低劣组。同时记忆良好组出现了穿孔性突触，而记忆低劣组则没有出现。还有的研究表明：在复杂空间环境中的大鼠，其海马结构中神经元的树突棘和突触的密度会有所增加，同时大鼠在水迷宫中的测试成绩也会有所改善^［5］。临床的研究亦证实突触的丧失对认知功能变化起作用，与正常衰老和AD的记忆能力下降密切相关^［6～8］。

　　在突触形态学的定量研究中，突触的数密度、平均面积和面密度是能够较好地反映突触形态学变化的体视学参数。我们的研究表明：D-半乳糖加速衰老合并Meynert基底核损毁的AD模型大鼠海马突触形态与正常老年组比较发生了明显的变化，表现为突触数量的减少和突触平均面积的增大。突触数目的减少可能是神经元死亡所致，而突触平均面积的增大，则可能是剩余突触试图通过增加自身的面积来代偿因突触丢失而造成的功能障碍所出现的一种病理改变。模型大鼠通过面密度反映出来的突触总面积增加的同时却伴有突触功能的障碍(如表现为学习记忆能力的下降)^［9］提示，模型组所表现出来的突触功能障碍不仅仅限于突触数量的减少，同时突触的“质量”也可能发生了改变。补肾益智方能够抑制模型大鼠突触的病理性重构，这表明其对海马突触可塑性机制的作用可能是其改善学习记忆的神经生物学基础之一。

图1　补肾益智方阻抑AD大鼠海马突触病理性重构的电镜观察

　　a.齿状回分子层突触超微结构(60kV,×40000)，标尺为200nm；b.正常组(60kV,×15000)，标尺为500nm；c.AD模型组(60kV,×15000)，标尺为500nm；d.双益平组(60kV,×15000)，标尺为500nm；e.，f.补肾益智方组(60kV，×15000)，标尺为500nm；突触小泡；突触后膜；↑突触间隙；▲穿孔性突触

　　在当前国内外许多学者致力于益智和AD等疾病防治药物的研究中，有学者大力倡导AD的突触干预策略，主张通过活化突触功能来改善AD等疾病认知障碍症状^［10］。而开展中药对突触可塑性影响的研究尚处于起步阶段^［11］。我们认为，基于已有的中药改善认知功能以及抗衰老和治疗AD的诸多临床和实验方面的研究成果，从学习记忆与突触可塑性的角度出发，筛选益智改善AD等疾病的认知障碍的中药单复方是完全可能也是十分有意义的。

　　基金项目：“九五”国家科技重点攻关项目(编号：96-906-09-02)

　　作者简介：第一作者，胡镜清　男，1965年出生，讲师，医学博士；

　　参考文献：

　　［1］胡镜清，赖世隆，王奇，等.补肾益智方对阿尔茨海默病大鼠模型脑内胆碱能神经系统的保护作用［J］.广州中医药大学学报，1999，16(3)：201

　　［2］Geinisman Y, De Toldeo-Morrell L, Morrell F. Loss of perforated synapses in the dentate gyrus： morphological substrate of memory deficit in aged rats［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1986，83:3027

　　［3］洪岸，姚志彬，顾耀铭，等.老年大鼠学习记忆减退与海马结构的突触素改变［J］.解剖学报,1996，27(2)：164

　　［4］章子贵，陆汉新，李振武，等.小鼠记忆保持能力与海马CA3区突触界面结构的相关性［J］.中国神经科学杂志，1995，2(3)：136

　　［5］Armstrong JN,Mclntyre DC,Neubort S, et al. Learning and memory after adrenalectomy-induced hippocampal dentate granule cell degeneration in the rat［J］.Hippocampus，1993，3:359

　　［6］Terry RD, DeTeresa R, Hansen LA. Neocortical cell counts in normal human adult aging［J］. Ann Neurol， 1987,21:530

　　［7］Terry RD, Masliah E, Salmon DP, Butters N,et al. Physical basis of cognitive alterations in Alzheimer's disease:synapse loss is the major correlate of cognitive impairment［J］.Ann Neurol, 1991,30:572

　　［8］Bertoni-Freddianri C, Giuli C, Pieri C, et al. Quantitative invesitgation of the morphological plasticity of synaptic junctions in dentate gyrus during aging［J］.Brain Res, 1986,366:187

　　［9］胡镜清，赖世隆，王奇，等.D-半乳糖加速衰老合并Meynert核损毁大鼠学习记忆能力变化的初步观察［J］.中华老年医学杂志，2000，19(2)：5

　　［10］Jellingre KA, ladurner G, Windisch M.(肖世富等译) Alzheimer 病诊断和治疗的新进展［M］.上海：上海医科大学出版社，1997.1～10

　　［11］汪健，娄艾琳.人参总皂甙对大鼠海马突触影响的形态定量研究［J］.基础医学与临床，1998，18(3)：61

收稿日期：2000-03-04