天泰Ⅱ号对实验性老年痴呆益智作用及机理探讨

中药新药与临床药理 1999年第1期第10卷 药效与毒理学研究

作者：吴正治　唐春艳　卢汉平

单位：吴正治　卢汉平　深圳市红会医院市中西医结合研究所，广东深圳 519029；唐春艳　中山医科大学基础学院，广州 510089

　　关键词： 天泰Ⅱ号胶囊；药理学；老年性痴呆；化学诱导；AlCl₃；毒性；学习；药物作用；记忆；药物作用

　　摘要：对老年小鼠以 AlCl₃ 复制老年痴呆模型，以特异性 M₁ 和 M₂ 受体亚型抗体检测模型小鼠海马 M₁ 和 M₂ 受体含量，观察天泰Ⅱ号对模型小鼠的作用效果。结果表明，模型小鼠海马 M₁ 和 M₂ 含量显著降低，天泰Ⅱ号可显著提高模型小鼠的学习记忆能力，并显著增加其海马 M₁ 受体亚型的含量，但对 M₂ 无明显影响。

　　分类号：R285.5

　　文献标识码：A

　　老年性痴呆(Alzheimer's disease，简称 AD)是严重危害老年人身心健康的重大疾病之一，现代医学尚缺乏有效的治疗方法^［1，2］。随着社会人口的老化，本病将带来日益严重的社会和医疗问题。研究表明，中枢M胆碱能受体在神经元信息传递过程中起重要作用^［3］，老年性痴呆与 M 胆碱能系统功能减弱关系密切^［4］。本文观察了中药复方天泰Ⅱ号对铝中毒老年痴呆模型小鼠学习记忆功能及相关脑区M受体亚型的影响。

　　1　材料与方法

　　1.1　动物及分组　昆明种纯系雄性小鼠(中山医科大学实验动物中心提供)，16 月龄，随机分为 5 组，第 1 组为正常对照组，第 2～5 组以 AlCl₃ 制造痴呆(学习记忆障碍)模型。

　　1.2　药物配制　M₁ 和 M₂单克隆抗体由中山医科大学博士后流动站赵树进博士后惠赠，临用前按 1∶400 及 1∶100 稀释。天泰Ⅱ号(由黄连、钩藤、郁金等组成，按确定的工艺制成胶囊)，去胶囊外壳，加适量双蒸水反复研磨，双层纱布过滤，药渣加双蒸水煎煮 2 次，过滤，合并 3 次药液，水浴浓缩至所需浓度。氢化麦角碱(Hydergine)由瑞士山德士药厂、天津华津制药厂合作生产(批号 960923)，以双蒸水配制。AlCl₃ 以注射用水溶解配制。

　　1.3　给药及造模　第 3 组每鼠每天给 Hydergine0.6mg/kg，第 4 组每鼠每天给天泰Ⅱ号6.8 g/kg，第 5 组每鼠每天给天泰Ⅱ号20.14 g/kg，以上药量均配成0.5 mL液体 ig(灌胃)给药，连续 60 d，第 1、2 组灌以等量双蒸水，灌胃给药第 5 天开始造模，第 2～5 组动物以 AlCl₃100 mg/kg 腹腔注射(ip)隔日 1 次，连续 50 d，以复制慢性铝中毒老年痴呆模型^［5，6］。

　　1.4　学习记忆功能测试^［7］　最后一次ip AlCl₃及灌胃给药 50 min 后，依跳台法以 MR 921 型小鼠跳台实验自动记录仪检测其学习记忆能力。

　　首先将其置于跳台仪中，适应环境 5 min 后，轻放于平台上，当动物从跳台上跳下四肢接触铜栅时，即给予 40 V 电压刺激，记录小鼠逃避至平台上的潜伏期(Escape Latency,EL)，并记录 5 min 内的触电次数(错误次数)，以此作为学习成绩。24 h 后进行测试，将小鼠置平台上，记录其第一次跳下受电击的时间(潜伏期)及其 3 min 内受电击的次数(错误次数)，以此作为记忆功能的评价指标。测试时，若小鼠停留在平台上超过 3 min，其潜伏期以 180 s计。

　　1.5　M 受体亚型检测　给药结束后，迅速断头取脑，在冰台上分离海马组织，加入经预冷的含0.32 mol.L^-1蔗糖的 PBS(pH 7.4)适量，以 Teflon 匀浆器匀浆 1 min 1000 g 4℃离心 10 min，取上清以 20 000 g 4℃离心 30 min，弃上清，沉淀以 1.0 mL包被液(Na₂CO₃ 1.7 g，NaHCO₃ 2.83 g)加蒸馏水溶解至 1 L，pH 9.6)分散得粗膜混悬液，取 0.1 mL 以 Lowry 法测其蛋白含量，据粗膜蛋白含量以包被液稀释为0.2 mg/L(测M₁)及 2.0 mg/L(测 M₂)的两种待测标本，取待测标本 100μL 包埋在 96 孔进口酶标板中 4℃过夜，以 PBS-Tween 20 液充分洗涤后，加 1%牛血清白蛋白进行封闭，37℃孵育 1 h，充分洗涤后各分别加入 1∶400 兔抗M₁ 受体 IgG 或 1∶100 兔抗 M₂ 受体 IgG(以正常血清为空白对照)，37℃温育 1 h，洗涤 3 次后各加入 1∶500 HRP 标记羊抗兔 IgG，37℃温育 1 h，洗涤 3 次。加 DAB 显色液 50μL，37℃30 min 后，加 2 mol*L^-1硫酸 50μL 终止显色。以 PYNATECH MR-5000 型酶标仪在 490 nm 波长下测量M₁ 和 M₂ 受体的含量(吸光度，用 OD 值表示)^［8］。

　　2　结　果

　　2.1　天泰Ⅱ号对老年铝中毒痴呆鼠学习记忆功能的影响，见表1。

表1　天泰Ⅱ号对小鼠学习、记忆成绩的影响(±s)

　　注：与模型对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与 Hydergine组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01；与大剂量组比较，@P＜0.05，@@P＜0.01。

　　2.2　天泰Ⅱ号对海马 M 受体亚型的影响，见表 2。

表2　天泰Ⅱ号对小鼠海马 M 受体亚型含量的影响(±s)

　　注：与模型对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01。

　　3　讨　论

　　学习记忆障碍是 AD 的主要症状。目前研究 AD 所用的模型大多为各种理化方法所致的学习记忆障碍模型。如 m 受体阻滞剂、蛋白质或 DNA 合成抑制剂、缺氧、电损毁或化学损毁海马、隔区等局部区域等。以老年动物用慢性铝中毒方法复制的老年学习记忆障碍模型应是研究 AD较为理想的模型之一^{［2，5～6］}。

　　研究表明：M 受体参与大脑的唤醒、选择性注意力、情绪和运动协调等功能的调节，特别在学习、记忆和认知等方面被认为是关键环节之一^［9］。已知 m 受体有 M₁、M₂、M₃ 和 M₄ 等多种亚型，脑 M 受体的亚型主要是位于突触后的 m₁ 型(约占脑 M 受体的 50%)，主要分布在皮层、海马等处，它接受突触前末梢乙酰胆碱的刺激，直接参与学习记忆的信息传递^［10］。M₂型受体主要分布于突触前纤维，约占中枢 M 受体的 10%～20%，受激动时对 ACh 的释放起抑制作用^［11］。目前对 M 受体的测定，通常采用放射配基法，常用的配基是［³H］QNB和［³H］PZ(Pirenzepine)，QNB 为非特异性 M 受体阻断剂，PZ 对 M₁ 和 M₂受体的选择性亦不高，因此放射配基法不能准确区分 M₁ 和 M₂ 受体量的差异。本文以特异性抗 M₁、M₂受体抗体，用 ELISA 法测量脑组织 M₁ 及 M₂ 受体量，具有特异性高、样品用量少、无放射性污染等优点^［12］。

　　目前，中医对老年痴呆病多从肾虚论治。我们认为，本病与肝胆密切相关。肝主谋虑，胆主决断，“十一脏皆取决于胆”；脑为髓海，乃元神之府；“髓之虚实，主于肝胆”(《删繁方》)。因此，精神情志活动尤其是谋虑，决断等高级智能活动的正常与肝胆关系十分密切，其为病有虚实之别，虚者肝虚胆寒，疏泄无力，脾土失疏，运化不健，精血乏源，髓海失充，致谋虑无权，决断失职，神明不用；实者肝郁化火，灼津为痰，胆热痰扰，气滞血淤，扰乱神明，闭阻清窍。均可导致老年痴呆病的发生，出现失忆、失认、失算、失断(判断)等临床表现。

　　天泰Ⅱ号由黄连、钩藤、郁金等组成，功能清肝泻火、解郁开窍。研究表明该药对 M 受体阻滞剂东莨菪碱认知障碍模型有明显的拮抗效果^［13］。本文进一步观察到天泰Ⅱ号能显著提高铝中毒老年痴呆小鼠的学习和记忆功能。海马是学习记忆的关键脑区，海马 m 受体的含量与学习记忆密切相关。目前认为激动中枢 M₁ 受体或阻断中枢 M₁ 受体均有利于学习记忆功能，本研究发现铝中毒老年小鼠海马 m₁、M₁ 受体亚型均明显降低，与有关报道一致^［11］。天泰Ⅱ号及 Hydergine 均能提高模型小鼠海马 m₁ 的含量，其大剂量组 M₁ 含量显著高于小剂量组，且其大剂量组 M₁ 受体量亦显著高于西药对照组。海马 m₂ 受体含量模型组与各给药组之间则均无明显差异。说明天泰Ⅱ号能选择性地激活海马 M₁ 受体亚型，这可能是天泰Ⅱ号对老年性痴呆学习记忆改善作用的重要机理之一。

　　备注基金来源：广东省优秀中青年专家科研目标责任项目，编号：96028。参　考　文　献

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(收稿日期：1998-09-28)