幽门螺杆菌在牙菌斑中的分布研究

牙体牙髓牙周病学杂志 1999年第1期第9卷 基础研究

作者：潘亚萍　　叶千红　　王红杨

单位：潘亚萍　叶千红　中国医科大学：口腔医学院；王红杨　第一临床学院；辽宁 沈阳 110002)

关键词：幽门螺杆菌；牙菌斑；牙周炎；PCR

　　摘要　　目的：为探讨幽门螺杆菌(HP)在口腔内的分布及感染方式，本实验对不同程度牙周炎患者46例，对照组20例进行了龈上及龈下菌斑研究。方法：采用PCR技术，提取HP的染色体DNA，对其特异性片段进行诊断。结果：牙周炎组HP阳性率平均39.1%，健康对照组15%，重症牙周炎组阳性率52.3%，显示了HP在口腔分布与年龄、牙位、牙周炎的程度密切相关。结论：牙菌斑是HP孳生地，口腔环境可能是HP一条传播通道，有关HP对牙周组织损害的研究尚待深入。

　　中图号：R780.2　　　 文献标识码：A　　　文章编号：1005-2593(1999)01-0001-03

　　［牙体牙髓牙周病学杂志，1999；9(1)：1］

　　Study the distribution of helicobacter pylori in dentalplaque by polymerase chain reaction

Pan Yaping, Yie Qianhong, Wang Hongyang

Department of Periodontology, Stomatological College of China Medical University, Shenyang 110002

　　Abstract　　Aim：Whether the oral cavity is a potential reservoir and possible sanctuary for Helicobacter pylori, we investigated the distribution of helicobacter pylori and its infection in tooth plaque.Methods: Forty-six patients with periodontitis and twenty controls with healthy were studied in the supergingival and subgingival plaques by polymerase chain reaction.Results: 18 patients(39.1%) with periodontitis was identified in their plaque, controls was 15%; to severe periodontitis,the HP positive rate 52.3%; the distribution of HP had relation with age, sex, teeth site,activities of periodontitis.Conclusions: The detection of HP in dental plaques suggested that HP colonization is not restricted to the gastric mucous and this ecological niche may serve be as a possible sanctuary which may be responsible for resettle of the stomach HP. Complete treatment to periodontitis is very important to periodontal and stomach health.

　　Key words　 helicobacter pylori； tooth plaque； periodontitis；PCR

　　［Chinese Journal of Conservative Dentistry, 1999,9(1):1］

　　幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, HP)是一种微需氧、革兰氏阴性螺旋形细菌，与慢性胃炎、胃十二指肠溃疡、胃癌等消化系统疾病的发病关系密切。虽然关于HP的流行病学研究较多，但其传播途径目前仍然不甚了解。国外某些学者近期发现HP也存在于牙菌斑中，提示口腔环境可能是一条HP的传播通道。口腔微生物的种类及数量非常庞大，在深牙周袋及根管内存在大量革兰氏阴性厌氧杆菌，可动菌，但培养及鉴定较为困难。本研究选择克隆的HP染色体DNA特异片段，通过获得极少量细菌DNA的方法，运用PCR技术研究幽门螺杆菌在口腔菌斑中的分布，探讨HP与牙周病的相互关系，旨在为幽门螺杆菌传播方式及流行病学研究提供有关数据。

　　1　材料和方法

　　1.1　选择对象

　　实验组：中国医科大学口腔医院牙周科门诊患者46例，均为成人牙周炎(诊断按照全国统编教材第三版口腔内科学标准)。男25例，女21例，平均年龄39.8岁。牙位选择为每一患者仅取一个牙齿的一个牙面菌斑，前牙8个，前磨牙13个，磨牙25个。所有患者在检查前2个月均未服用抗生素，去除龈上菌斑，取龈下菌斑，对于牙龈指数为3以上者，同时留取龈上菌斑，置入装有无菌生理盐水的尖底离心管，-40℃保存备检。

　　对照组：选择口腔卫生状况良好，无牙周疾病者20例，男11例，女9例，平均年龄35.3岁，前牙3个，前磨牙5个，磨牙12个，与实验组同样取龈下菌斑备检。

　　1.2　标本处理

　　将备检的牙菌斑放入400μl无菌生理盐水中12?000r/min×5min，弃上清，加入DNA裂解液50μl，蛋白酶K 2μl，对于大块牙石或组织可用枪头研磨，磨碎为止，55℃水浴1h，100℃沸水中置10min，同时设置阳性模板和阴性对照(由伊利康公司提供试剂盒)，15?000r/min×5min，取5μl进行PCR。

　　1.3　PCR检测

　　取扩增产物15μl，用15g/L琼脂糖凝胶(含0.5g/L溴化乙锭)经TAE电泳缓冲液，电泳30min(电压5V/cm)在紫外透射反射仪300nm下观察结果，若在200bp处出现橙黄色条带，则诊断为HP阳性。

　　2　结果

　　2.1　牙周正常部位，GI为零的龈下菌斑中，HP阳性率15%，牙周病组平均检出率39.1%，重症牙周病组，GI为3以上者，HP检出阳性率52.3%，两者与对照组比较P＜0.05，有显著差异(表1)。

表1　不同程度牙周病变HP的检出率

　　* P＜0.052.2　牙龈指数为3以上者，同一牙面取龈上及龈下菌斑显示龈上、龈下各为两个区域，龈下菌斑中HP阳性者多(表2)。

表2　重症牙周炎同一牙位龈上、龈下菌斑HP检出比较

　　2.3　对于牙龈指数为3以上者，对其牙位及不同年龄进行了比较，显示磨牙区HP阳性者较其他牙位检出率高，组间比较有显著差异，在年龄上HP阳性者多见于中老年牙周炎患者(表3，4)。

表3　不同牙位HP检出阳性比较

　　* P＜0.05

表4　不同年龄组HP阳性率比较

　　3　讨论

　　自1990年Hoshina等首先用PCR技术检测HP感染以来，其高敏感性及高特异性受到医学界重视^［1］，聚合酶链反应能选择性大量扩增目的基因10⁶倍，是一种快速、简便、精确、特异性及敏感性均高的方法，本实验选用Valentine方法，原理是从HP克隆文库中随机克隆，取一段长度为1.9kb的染色体DNA，从中构建一对20mer引物，即CAM-2 5’CATCTTGTTAGAGGGATTGG3’和CAM-4 5’TAACAAACCGATAATGGCGC 3’，再用PCR扩增后所得产物经琼脂糖凝胶电泳和同源的³²P标记的20mer寡核苷酸探针CAM-3 5’CGCTCTTTAGTTTTGGAGCG 3’作Southern杂交后，确认其中一段203bp特异产物。本方法检出灵敏度最高为一个拷贝的克隆质粒DNA或是100个HP细胞，而扩增其它相近菌株未发现这一特异产物。

　　虽然有二人报道从牙菌斑中分离培养出HP^［3，4］，但从牙菌斑分离培养HP仍有很大困难。以往报道多从消化疾病患者中选择进行牙菌斑检测，如Nguyen等^［5］采用RT-PCR扩增16S-DNA基因检测25例消化不良患者的胃粘膜组织标本中有18例HP阳性胃炎，其中7例患者牙菌斑中检出了HP(38.3%)。印度学者Majmuder用尿素酶法证实40例志愿者100%牙菌斑HP阳性，由于口腔很多革兰氏阴性厌氧菌尿素酶的试验阳性，此结果并不十分可靠。

　　本实验运用PCR技术，不考虑是否为胃炎患者，根据牙周病变程度将患者分类，显示了在重症牙周炎组HP阳性率52.3%，远高于正常对照组15%，提示口腔内的生态环境可能是HP孳生所在地。虽然某些学者认为胃炎与HP最为密切，口腔仅是一个传播通道，但也有人发现胃HP检出阴性者口腔内也可能为阳性^［6］。本实验显示牙周病变处于活动期，即红、肿、溢脓较重者，HP检出率高，表明HP在口腔内生存与年龄、性别、牙位及牙周病变程度有关。作者最为感兴趣的是幽门螺杆菌在牙周病感染中起什么作用，由于HP在口腔中培养难以成功及口腔牙周袋内存在的众多细菌，它对牙周组织的病理损害机制尚无从下结论。

　　本文结果显示正常口腔的龈下菌斑中也存在同样细菌。在所有实验病例中，作者都仔细询问了每人的既往史，尤其是胃病史，由于未作胃镜检查，仅极少数自诉有胃炎，资料表明HP感染方式可为口-粪、口-口间传染，如家族式、家庭式感染或一过性菌群存留^［7］。若口腔卫生状态良好，HP消除的可能性大，若口腔生态环境较差，如磨牙区深牙周袋，则成为HP栖居地，对牙周组织也造成一定伤害。因此HP在口腔的存在与消化疾病再发或无法根治可能存在着必然联系。彻底治疗牙周病，消除牙周袋，是治疗牙周病的主要措施，提示对消化疾病的根治可能也是必要的。参考文献

　　1　 Hoshina S, Kahnsm, Jiang W et al. Direct detection and amplification of helicobacter pylori ribosomal 16S gene segments from gastric endoscopic biopsies. Diagn Microbiol Infect Dis, 1990,13(6):433

　　2　 Valentine JL, Arthur RR, Mobley HL et al. Detection of HP by the PCR. J Clin Microbiol, 1991,29:689

　　3　 Krajden SM, Fuksa J, Anderson J et al. Examination of human stomach biopsies, saliva, and dental plaque for Campylobacter pylori. J Clin Microbiol,1989,27:1397

　　4　 Majmuder P, Shah SM, Dhuajibhoy KR et al. Isolation of Helicobacter pylori from dental plaques in healthy volunteers. Indian J Gastroenterol, 1990,9:271

　　5　 Nguyen AM, Engstrand L, Genta RM et al. Detection of HP in Dental plaque by reverse transcription-PCR. J Clin Microbial, 1993,31:783

　　6　 Desai HG, Gill HH, Shankaran K et al. Dental plaque; a permament reservoir of Helicobacter pylori? Scand J Gastroentero, 1991,26:1205

　　7　 佟伟军，赵宏林，韩淑英等. 幽门螺杆菌感染危险因素的对数线性模型分析. 新消化病学杂志，1996，4：217

收稿日期：1998-05-27

　　修回日期：1998-11-12