鼻咽癌细胞凋亡及凋亡相关基因的表达

中华肿瘤杂志 2000年第2期第22卷 临床研究

作者：李杰恩　唐安洲　黄光武　徐志文　周永　谭颂华　韦敏怡

单位：李杰恩（广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科，南宁，530021）；唐安洲（广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科，南宁，530021）；黄光武（广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科，南宁，530021）；徐志文（广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科，南宁，530021）；周永（广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科，南宁，530021）；谭颂华（广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科，南宁，530021）；韦敏怡（广西医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科，南宁，530021）

　　关键词： 鼻咽肿瘤；细胞凋亡；p16基因；bcl-2基因

　　【摘要】　目的　探讨细胞凋亡在鼻咽癌（NPC）中的作用。方法　采用TdT酶介导的生物素化dutp缺口末端标记技术（Tunel）和免疫组化S-P法，分别检测20例正常鼻咽粘膜组织及73 例NPC组织的细胞凋亡率和p16、bcl-2基因的表达。结果　正常鼻咽粘膜细胞凋亡率显著高于NPC（P＜0.01），p16、bcl-2在NPC组织中的表达分别为28.8%（21/73）、81.2%（59/73），在正常粘膜的表达分别为90.0%(18/20)、15.0%(3/20)。NPC中bcl-2表达与癌细胞凋亡率呈负相关，而p16则与凋亡率呈正相关（P＜0.01）。NPC的3年生存率资料表明，细胞凋亡率＞2.0、bcl-2表达阴性、p16表达阳性的患者预后较佳。结论　在NPC中，癌细胞凋亡明显受到抑制，其发生可能与bcl-2及p16基因调控障碍有关。NPC细胞凋亡与患者的预后相关。

Apoptosis and apoptosis-related gene expression in nasopharyngeal carcinoma

LI Jieen, TANG Anzhou, HUANG Guangwu, et al.

　　（Department of Otolaryngology, First Affiliated Hospital, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China）

　　【Abstract】　Objective　To study apoptosis and expression of apoptosis-related genes in nasopharyngeal carcinoma(NPC).Methods　Paraffin-embedded tissue blocks from 73 cases of NPC and 20 cases of chronic nasopharyngitis were used in this study. Using terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP biotin nick end labeling (Tunel) and immunohisytochemistry S-P method, the apoptotic rate (AR) and expression of p16 and bcl-2 protein were examined.Results　Few apoptotic cells were found in NPC, the AR significantly lower than that of chronic nasopharyngitis (P＜0.01). The frequency of expression of p16 and bcl-2 in NPC was 28.8% (21/73) and 81.2% (59/73), respectively, while that in chronic nasopharyngitis was 90% (18/20) and 15%(3/20), respectively. In NPC, expression of p16 was positively correlated, while bcl-2 negatively correlated with the AR (P＜0.01). According to 3-year follow up, the survival rate was higher in NPC patients with AR＞2.0 and negative bcl-2 expression, whereas that was higher in patients with positive expression of p16.Conclusion　Apoptosis is inhibited in NPC which may be related to p16 and bcl-2 gene dysregulation. Apoptosis correlates with prognosis in NPC patients.

　　【Subject words】　Nasopharyngeal neoplasms;　Apoptosis;　p16 gene;　bcl-2 gene;

　　近来研究表明，细胞凋亡与肿瘤的发生、发展、治疗和预后关系密切，因而成为肿瘤研究的新热点。细胞凋亡的诱导与抑制是受遗传因素影响的，许多基因参与了这一过程。为探讨细胞凋亡及凋亡相关基因p16、bcl-2在NPC发生发展中的作用，我们采用TdT酶介导的生物素化dutp缺口末端标记技术(Tunel)和免疫组化S-P法对NPC组织进行了研究。

　　材料与方法

　　1.临床资料：73例NPC患者的临床资料及石蜡标本，均经病理证实为低分化鳞癌。男54例，女19例，年龄17～73岁，平均42岁。中位随访时间为37个月。其中19人因复发转移死亡，5人失访。另取20例鼻咽粘膜慢性炎症组织作对照组。

　　2.试剂：采用德国宝灵曼公司生产的原位末端标记试剂盒。p16、bcl-2单抗及免疫组化试剂盒等购自北京中山生物公司。

　　3.染色：采用Tunel法检测NPC及鼻咽粘膜慢性炎症组织中细胞凋亡情况。坚固红染色，严格按凋亡检测试剂盒说明书操作，并做阳性及阴性对照。p16、bcl-2基因检测采用免疫组化S-P法，工作浓度分别为1∶50，1∶40。苏木素复染。

　　4.结果判断：Tunel标记的阳性细胞判断按试剂盒说明，即光镜下散在的细胞核被标记成红色的细胞即为凋亡细胞。细胞凋亡率(AR)以光镜下计算1 000个细胞中的阳性细胞数来表示。p16、bcl-2的阳性细胞膜及细胞浆呈棕黄色（图1～3）。

　　图1 红色为坚固红衬染的凋亡细胞,散在分布于癌细胞中 Tunel×400 图2 蛋白阳性的细胞浆及细胞核呈棕黄色 SP染色×400 图3 bcl-2蛋白阳性的细胞膜及细胞浆呈棕黄色 SP染色 ×400

　　5.数据处理：使用PEMS（华西医科大学统计学教研室）统计软件包对数据进行统计学处理，χ²、t检验及等级相关分析，生存曲线比较用Log-rank检验。

　　结果

　　1.NPC与正常鼻咽粘膜的细胞凋亡：73例NPC中，p16、bcl-2染色阳性分别为21例、59例，正常粘膜分别为18例、3例；NPC的凋亡率为1.72，正常鼻咽粘膜凋亡率为3.17，两者相比，差异有显著性（P＜0.01，）。

　　2.细胞凋亡及p16、bcl-2基因表达与临床的相关性：NPC中细胞凋亡与病灶大小及临床分期无关；但NPC复发或转移死亡患者的细胞凋亡指数明显低于无复发转移者（P＜0.01）。p16、bcl-2与NPC病灶大小、临床分期无关。

　　3.细胞凋亡与p16、bcl-2之间的相关性：NPC细胞凋亡与p16基因表达呈正相关（r=0.25，P＜0.05），与bcl-2 呈负相关（r=-0.83，P＜0.01）。p16与bcl-2呈负相关（等级相关分析，r=0.47，P＜0.01）。

　　4.NPC的AR及p16、bcl-2基因表达阳性组和阴性组放疗后的生存曲线差异有显著性（Log-rank检验，P＜0.05，图4～6）。

　　讨论

　　细胞凋亡是细胞死亡的基本形式之一，不仅在正常的生理状态具有重要作用，而且与多种疾病的发生发展密切相关^［1］。近年来研究认为，细胞凋亡异常可能与肿瘤发生有关。凋亡调控基因已被看作一类新的肿瘤发生相关基因。肿瘤的发生，是由于细胞增殖与细胞凋亡平衡失调的结果^［2］，细胞凋亡在肿瘤生长过程中起负调控作用，可以阻碍肿瘤迅速增长。我们采用原位细胞凋亡染色技术发现NPC组织中出现自发的细胞凋亡，且多见于癌间质，周围常有淋巴细胞浸润。尽管其AR明显低于正常鼻咽粘膜组织，但说明NPC患者肿瘤内细胞凋亡机制仍然存在，并推测其细胞凋亡的发生可能与淋巴细胞的免疫诱导作用有关。张帆等^［3］证实IgM可诱导B淋巴瘤Daudi细胞凋亡。但在免疫缺陷的NPC荷瘤裸鼠的移植瘤组织中却发现大量的凋亡细胞^［4］，这种瘤细胞凋亡不可能是细胞免疫的结果。目前认为是凋亡调控分子参与的结果^［5］。我们采用免疫组化S-P法检测NPC组织中p16、bcl-2基因表达，结果表明，NPC细胞凋亡率与p16呈正相关，与bcl-2呈负相关，说明NPC中p16的缺失，不能竞争结合CDK4阻止细胞分裂，增生的细胞失去控制而向癌变发展。本研究结果表明，NPC组织中bcl-2的表达程度与患者血清中的EBVCA IgA抗体滴度平行，说明与NPC细胞发生有关的EB病毒LMP-1蛋白能使NPC细胞的bcl-2表达增强，从而抑制EB病毒感染导致的细胞凋亡，因而发生肿瘤^［5］。我们的结果表明，p16、bcl-2基因表达阳性组和阴性组放疗后的生存曲线差异有显著性（Log-rank检验，P＜0.05），因此认为NPC的发生、发展及预后与p16基因的缺失及bcl-2基因的过度表达有关。

图4　AR＞2.0与AR＜2.0患者生存曲线的比较(P＜0.05)

图5　p16阳性组与阴性组生存率的比较(P＜0.05)

图6　bcl-2阳性组与阴性组生存率的比较(P＜0.05)

　　我们发现，NPC的细胞AR与病灶大小无关，但与预后相关。本组病例随访发现，经治疗后，NPC复发或转移死亡患者的细胞AR明显低于无复发转移者（P＜0.01），AR＞2.0的生存率明显提高，说明细胞凋亡指数高的患者对治疗亦较敏感，疗效亦好，可以作为判断疗效及预后的指标。NPC患者细胞凋亡与p16基因的缺失及bcl-2基因的过度表达有关，至于何种原因引起p16基因的缺失及bcl-2基因的过表达，尚待进一步研究。

　　基金项目：广西卫生厅青年基金资助项目

　　参考文献：

　　［1］　Thompson CB.Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science,1995,267:1465.

　　［2］　Evan G, Littlewood T. A matter of life and cell death. Science,1998,281:1317-1321.

　　［3］　张帆，朱红霞，全兰萍，等.IgM诱导人B淋巴瘤Daudi细胞凋亡.癌症，1999，18：121-125.

　　［4］　李智，傅茂福，宗永生.鼻咽癌细胞株裸鼠移植瘤中癌细胞的凋亡.癌症，1999，18：172-175.

　　［5］　Henderson S, Rowe M,Gregory C, et al.Induction of bcl-2 expression by Epstein-Bair virus latent membrane protein 1 protects infected B cells from programmed cell death. Cell 1991,65:1107-1111.

收稿日期：1999-05-26