E-cadherin基因突变对膀胱癌侵袭能力影响的研究

中华泌尿外科杂志 1999年第5期第20卷 论　著

作者：侯树坤　朱积川　张小东　李鹰　王晓峰

单位：100044 北京医科大学人民医院泌尿外科

　　关键词： 膀胱肿瘤,癌,基因突变

　　【摘要】　目的　观察E-cadherin基因突变对膀胱癌侵袭力的影响。　方法　对40例新鲜膀胱癌标本分别完成体外matrigel穿膜侵袭实验和E-cadherin基因的序列测定。　结果　病理分级Ⅰ、Ⅱ级者32例中仅有2例出现E-cadherin基因突变，而Ⅲ、Ⅳ级者8例中有4例出现突变，说明E-cadherin变化与肿瘤细胞分化之间有明显的相关性。本组6例标本出现E-cadherin结构改变，其中4例穿膜侵袭实验阳性，而34例未发现E-cadherin基因改变的标本中，只有7例穿膜侵袭实验阳性。　结论　E-cadherin基因改变对肿瘤细胞的侵袭能力有明显影响。未发现E-cadherin基因突变的标本也可能具有侵袭能力，说明在膀胱肿瘤的侵袭过程中存在其它机制。

　　Influence of E-cadherin mutation on the invasive ability of bladder tumor cells　HOU Shukun,ZHU Jichuan,ZHANG Xiaodong,et al.Department of Urology,People's Hospital,Beijing Medical University,Beijing 100044

　　【Abstract】　Objective　To clarify the influence of E-cadherin on the invasive ability of bladder tumor cells.　Methods　40 fresh bladder cancer tissues were investigated by matrigel invasion assay and direct sequencing of amplified E-cadherin complementary DNA fragments.　Results　In 32 grade Ⅰ and Ⅱcases,E-cadherin mutation was identified in only 2 while it was detected in 4 of 8 grade Ⅲ and Ⅳ cases revealing a positive correlation between E-cadherin mutation and the differentiation of tumor cells.E-cadherin alteration was detected in 6 cases of which 4 specimens showed invasive ability on matrigel invasion assay.Only 7 of the 34 cases without E-cadherin alteration penetrated the matrigel barrier.　Conclusions　E-cadherin mutation can significantly influence the invasive ability of tumor cells.On the other hand,some tumors without E-cadherin alteration may also have invasive ability denoting that other mechanisms should be consi-dered.

　　【Key words】　Bladder neoplasms,Carcinoma,Gene mutation

　　Cadherin是钙离子依赖的细胞粘连因子，参与多种细胞功能，而E-cadherin(epithelial cadherin)作为cadherin家族的一个成员，主要介导细胞之间的粘连反应。E-cadherin表达的下调是肿瘤细胞侵袭的原因之一^［1，2］。目前对于膀胱肿瘤E-cadherin的研究多侧重于其蛋白或mRNA的表达水平，而有关其结构改变对于膀胱肿瘤侵袭能力的影响尚未见报道。我们对40例膀胱肿瘤的E-cadherin基因序列进行测定，就其与肿瘤侵袭能力的关系进行分析。

　　材料与方法

　　1996年1月～1997年12月间，于手术过程中取部分新鲜膀胱肿瘤组织，分别进行下列实验。

　　一、细胞培养

　　1640培养液。采用机械分散法进行培养，并采用胶原酶消化法去除成纤维细胞^［3］。

　　二、侵袭实验

　　在Boyden Chamber下室中加入含有趋化因子的1640细胞培养液200μl，然后将铺有matrigel的聚碳酸酯微孔膜置于其上。上室加入保温1小时的细胞悬液200μl(2×10⁵)，常规培养24小时后取膜固定染色并计数^［4］。

　　三、膀胱癌细胞RNA的提取

　　采用Trizol试剂盒提取^［5］。

　　四、E-cadherin外显子8，9，10 PCR 产物的扩增及纯化

　　1.PCR引物的序列设计：扩增外显子8，9的引物序列为：P1：5′-ACCTCTGTGATGGAGGTC；P2：5′-CCACATTCGTCACTGCTACG。扩增外显子10的引物序列为：P1：5′-CTGAAAGTGACTGATG

　　CTG；P2：5′-TGTGTACGTTGCTGTTCTTCAC。

　　2.PCR反应条件：94℃ 1分钟；55℃ 1分钟；72℃ 2分钟，共30个循环，72℃延伸2分钟。

　　3.PCR产物的纯化：采用glassmilk对PCR产物进行纯化^［6］。

　　五、E-cadherin外显子8，9，10cDNA的测序分析

　　采用双脱氧链终止法对PCR产物直接测序分析，测序PCR的引物如下：扩增外显子8，9的引物序列为：P1：5′-ACAGGAACACAGGAGTCATC；P2：5′-CTGCTACGTGTAGAATGTAG。扩增外显子10的引物序列为：P1：5′-TGGACAATTTGTCGTCA

　　CCA；P2：5′-CGGATTAATCTCCAGCCAGT。

　　PCR的反应条件为94℃ 4分钟，94℃ 40秒，50℃ 30秒，72℃ 60秒，35个循环，72℃延伸2分钟。然后进行电泳测序。

　　结　果

　　一、体外matrigel侵袭实验

　　40例膀胱肿瘤标本中11例标本穿膜阳性(有细胞穿过即为阳性)，与E-cadherin基因突变、病理分级的关系见表1。

表1　穿膜阳性与病理分级、E-cadherin基因突变的关系

　　二、40例膀胱肿瘤E-cadherin基因外显子8，9，10经PCR扩增后，其扩增产物分别用2%的琼脂糖凝胶电泳分析其长度。其中患者17外显子8，9丢失，患者14外显子10丢失。对其余标本的测序分析发现，患者4出现点突变，CTG突变为CAG，患者19出现CTG突变为CTA，而患者30则出现碱基丢失，丢失的3个碱基为GGC，患者34则丢失了碱基A(表2)。

表2　E-cadherin基因突变与侵袭能力及病理分级的关系

　　三、E-cadherin基因突变对膀胱肿瘤侵袭力的影响

　　在6例出现E-cadherin结构异常的患者中4例穿膜阳性，而34例E-cadherin结构未发现异常的患者中穿膜阳性者为7例，表明E-cadherin的突变与肿瘤细胞的侵袭能力密切相关。

　　四、肿瘤细胞的分化与E-cadherin突变之间的关系

　　40例患者中病理分级为Ⅰ、Ⅱ级者共32例，有2例出现E-cadherin基因突变(6.2%)；而病理分级为Ⅲ、Ⅳ级者共8例，4例出现E-cadherin基因突变(P＜0.05)。

讨　论

　　侵袭和转移是恶性肿瘤的特征性改变，也是构成肿瘤患者死亡的重要原因。恶性肿瘤侵袭和转移的机制极其复杂。有研究表明，肿瘤细胞间的粘附在肿瘤的侵袭过程中起重要作用。目前知道与粘附过程有关的因子有4大类，其中，cadherin是一类Ca离子依赖性的跨膜糖蛋白，主要介导细胞之间的粘附反应。E-cadherin作为cadherin家族的一个成员，主要介导细胞之间的粘连反应，E-cadherin表达的下调是肿瘤侵袭的原因之一^［4］。

　　膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的肿瘤，肿瘤是否侵犯周围组织对患者的预后影响较大。目前，有关膀胱肿瘤E-cadherin的研究多侧重于蛋白或mRNA的表达水平，但蛋白或者mRNA的表达水平并不能反映出E-cadherin基因的结构及功能的完整性^［7］。本实验即侧重于研究E-cadherin基因结构的变化对于肿瘤侵袭力的影响。

　　E-cadherin基因包括13个外显子，其中外显子8，9，10为E-cadherin钙结合位点的编码区，如果这些区域的基因改变，E-cadherin蛋白的钙结合位点也会发生相应改变，使E-cadherin分子在功能上呈惰性。如果这些外显子完全丢失，则会大大损害肿瘤细胞之间的相互粘连，导致肿瘤细胞的分散和转移。本研究结果表明，在6例基因结构发生改变的病例中有4例侵袭实验阳性，说明E-cadherin在肿瘤侵袭过程中有重要作用。但另一方面，在穿膜实验阳性的11例患者中还有7例并未出现E-cadherin结果的改变，说明在肿瘤侵袭的过程中存在其它机制：(1)catenin传导从E-cadherin到细胞骨架的粘附信号，如果catenin发生改变或者下调，亦可使E-cadherin的粘附功能减低；(2)E-cadherin基因包含多个外显子，除外显子8，9，10外，其他区域也可能发生突变，并可影响其粘附功能^［8］。

　　有报道E-cadherin蛋白的表达水平与肿瘤的病理分级成负相关^［8］，而本实验的40例标本中，Ⅰ，Ⅱ级者共32例，仅2例出现E-cadherin基因突变，而Ⅲ，Ⅳ级者8例中有4例出现E-cadherin基因结构的改变。显示随肿瘤病理分级的增加，E-cadherin基因发生突变的机率明显增加。提示E-cadherin基因在肿瘤的分化过程中有重要作用。

　　综上所述，E-cadherin基因的改变对于肿瘤细胞的分化有重要影响，并在肿瘤的侵袭过程中起着重要的作用。

　　本课题受国家自然科学基金资助(39570700)

　　参考文献

　　1　Takeichi M.Cadherin cell adhesion receptors as a morphogenetic re-gulator.Science,1991,251∶1451-1455.

　　2　Frixen UH,Behrens J,Sachs M,et al.E-cadherin-mediated cell-cell adhesion prevents invasiveness of human carcinoma cells.J Cell Biol,1991,113∶173-185.

　　3　鄂征.组织培养和分子细胞学技术.第1版.北京：北京出版社.1995，133-138.

　　4　Albini AY,Iwamoto HK,Kleinman GR,et al.A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells.Cancer Res,1987,47∶3239-3245.

　　5　Murdoch B,Pereira DS,Wu X,et al.A rapid screening procedure for the identification of high-titer retrovirus packaging clones.Gene Ther,1997,4∶744-749.

　　6　Boyle JS,Lew AM.An inexpensive alternative to glassmilk for DNA purification.Trends Genet,1995,11∶8.

　　7　Karl-Friedrich Becker,Michael J,Atkinson,et al.E-cadherin gene mutations provide clues to diffuse type gastric carcinomas.Cancer Res,1994,64∶3845-3852.

　　8　Mayer B,Johnson JP,Leitl F,et al.E-cadherin expression in primary and metastatic gastric cancer:down-regulation correlates with cellular dedifferention and glandular disintegration.Cancer Res,1993,53∶1690-1695.

(收稿：1998-06-01)