大肠杆菌CD自杀基因与GM-CSF基因联合转移对小鼠红白血病的治疗作用
中华血液学杂志 1998年第6期第19卷 论 著
作者：鞠佃文 曹雪涛 王宝梅 孔令非 银平章 万涛 陶群 章卫平
关键词： 基因疗法；胞嘧啶脱胺酶；粒-巨噬细胞集落刺激因子；5氟胞嘧啶；腺病毒；红白血病
摘要 目的：观察自杀基因与细胞因子基因联合转移的抗肿瘤作用与免疫机制。方法：将表达大肠杆菌胞嘧啶脱胺酶(CD)的重组腺病毒(Ad-CD)及表达小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因的重组腺病毒(Ad-GM-CSF)直接进行体内注射，合并应用5氟胞嘧啶(5FC)对红白血病皮下荷瘤小鼠模型进行治疗。结果：联合基因治疗能显著抑制荷瘤小鼠皮下肿瘤的生长，并明显延长其生存期(P＜0.05)；免疫功能检测表明，联合基因治疗组小鼠CTL杀伤活性明显高于单用Ad-CD/5FC、Ad-GM-CSF、对照病毒Ad-LacZ/5FC或PBS治疗组；病理分析显示，联合基因治疗组肿瘤细胞发生明显坏死，瘤内及瘤周有大量的炎性细胞浸润。结论：应用自杀基因与细胞因子基因联合转染可更有效地抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，且可诱导抗肿瘤免疫应答。
Therapeutic effects of combined suicide gene and cytokine gene therapy on erythroleukemia-bearing mice Ju Dianwen, Cao Xuetao, Wang Baomei, et al.Department of Immunology, Second Military Medical University, Shanghai 200433
Abstracts Objective：To explore the antitumor effect of combined transfer of suicide gene and GM-CSF gene in erythroleukemia-bearing mice.Methods: Adenovirus harboring E.coli. cytosine deaminase (CD) gene (Ad-CD) and/or GM-CSF gene (Ad-GM-CSF) were used for the treatment of erythroleukemia-bearing mice. The mice were inoculated with FBL-3 erythroleukemia cells subcutaneously and 3 days later received Ad-CD followed by 5-fluorocytosine (5FC) treatment with or without Ad-GM-CSF.Results: The mice received Ad-CD/5FC and Ad-GM-CSF developed tumors more slowly and survived much longer than those received Ad-CD/5FC alone, Ad-GM-CSF alone, control virus Ad-LacZ/5FC or PBS. Combined transfer of CD gene and GM-CSF gene induced a higher specific CTL activity than control therapies did. Pathological examination illustrated that there were tumor necrosis and massive lymphocyte infiltration in the mice after the combined therapy.Conclusion: Combined transfer of suicide gene and cytokine gene could synergistically inhibit the growth of erythroleukemia cells in the mice and induce tumor specific immunity of the host.
Key words Gene therapy Cytosine deaminase Granulocyte-macrophage colony stimulating factor 5 Fluorocytosine Adenovirus Erythroleukemia
自杀基因转移已经广泛地用于各种恶性肿瘤的基础和临床试验性治疗［1,2］。其中大肠杆菌胞嘧啶脱胺酶（CD）联合5氟胞嘧啶（5FC）可通过细胞毒和旁观者效应杀伤结肠癌、直肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌等肿瘤细胞［3,4］。细胞因子的免疫基因治疗对包括白血病在内的各种肿瘤亦具有一定的疗效［5］。我们拟以重组腺病毒为载体介导CD基因及小鼠粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因体内联合转移，发挥自杀基因直接杀伤肿瘤细胞，而GM-CSF基因可以诱导抗肿瘤免疫的优势，克服单纯应用细胞因子基因对肿瘤直接杀伤作用不强，而单用自杀基因不能有效地诱导机体抗肿瘤免疫的弊端。我们观察二者联合转移对小鼠红白血病的治疗作用，并初步探讨了其免疫机制。
材料和方法
1 主要试剂 RPMI1640培养基购自Gibco公司，Na251CrO4 购自Amersham公司， 5FC购自Sigma公司。
2 动物及细胞株 C57BL/6小鼠，雌性，6～8周龄，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司。小鼠红白血病细胞株FBL-3由本室常规传代培养。复制缺陷型重组腺病毒包装细胞——人胚肾细胞株293细胞由德国柏林MDC分子医学中心 Blankenstein 博士惠赠。
3 重组腺病毒扩增 重组腺病毒载体Ad-CD 、Ad-LacZ及Ad-GM-CSF由日本东京癌症化疗中心分子生物治疗研究部Hamada 教授构建并提供。293细胞接种培养瓶1天后更换新鲜完全培养基，按MOI值20加入重组的腺病毒Ad-CD、Ad-GM-CSF或Ad-LacZ，继续培养观察，当293细胞多数脱落时，收集细胞，反复冻融6次(速冻慢融)，在高速低温离心机中离心(4000r/min, 20分钟，4℃)，取上清， 用293细胞变性法检测病毒滴度，-70℃保存备用。
4 小鼠荷瘤模型的建立及治疗观察 取生长良好的野生型FBL-3细胞，用PBS洗两遍后，以1×106/ml悬浮于PBS中，每只C57BL/6小鼠右侧胁肋部皮下注射0.2ml即2×105个FBL-3细胞。3天后将荷瘤小鼠随机分为5组： PBS对照组、对照腺病毒Ad-LacZ/5FC组、Ad-CD/5FC组、 Ad-GM-CSF组以及Ad-CD/5FC联合Ad-GM-CSF组。 荷瘤部位皮下分别注射0.1ml PBS或109pfu/ml重组腺病毒， 次日起，腹腔内分别注射0.5ml PBS或5FC(300mg/kg)，连续10天。荷瘤后第10天，瘤体内第2次注射PBS或相应病毒。于荷瘤后第10天起每两天一次测量肿瘤大小，测瘤体长短径(A、B)，瘤体用Amm×Bmm表示。末次治疗3天后，进行机体免疫功能及肿瘤组织的病理学检测。每组留5只荷瘤小鼠，观察治疗后小鼠存活时间。
5 常规组织学检查 肿瘤局部组织块用10%中性甲醛液固定，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、常规切片(厚度4μm)、HE染色后封片镜检。
6 荷瘤小鼠脾细胞CTL活性的诱导及测定 将野生型FBL-3细胞经120Gy60Co照射后，用于体外诱导脾CTL。用上述荷瘤小鼠脾脏制成脾淋巴细胞悬液，将其与灭活的FBL-3细胞以20∶1的比例置于含20%FCS、20U/ml重组IL-2的RPMI1640培养基中，于37℃、5%CO2孵箱中孵育6天后，检测CTL杀伤活性。活性测定采用4小时51Cr释放法，FBL-3细胞作为靶细胞，每组设2个效靶比(E∶T为25∶1及50∶1)，每个比例设3个复孔，检测每孔靶细胞被杀伤后释放的放射性核素每分钟闪烁计数(c/min)值，实验中自然释放率均低于20%。CTL活性按下式计算:
杀伤活性(%)=(实验组c/min－自然释放组c/min)/(最大释放组c/min－自然释放组c/min)
×100%
7 统计学处理 用未配对t检验。
结果
1 体内联合基因治疗对红白血病小鼠肿瘤生长的影响 C57BL/6小鼠皮下接种FBL-3细胞3～7天后，可触及肿瘤的生长，由图1可见，PBS对照组及Ad-LacZ/5FC组的小鼠皮下肿瘤生长迅速， Ad-CD/5FC组或Ad-GM-CSF组的小鼠肿瘤生长明显受到抑制，与PBS对照组及Ad-LacZ/5FC组比较，均有明显差别(P＜0.05)。而联合应用Ad-CD/5FC及Ad-GM-CSF组的小鼠肿瘤生长最为缓慢，与其余各组比较，均有显著差异(P＜0.05)。表明体内联合基因治疗有显著的肿瘤生长抑制作用。
图1 Ad-CD/5FC和(或)Ad-GM-CSF对红白血病
小鼠皮下肿瘤生长的抑制作用
2 体内联合基因治疗后红白血病小鼠存活期的改变 由图2可见，红白血病小鼠经不同治疗后，其平均存活期PBS对照组为28.6天，对照病毒Ad-LacZ/5FC组为25.8天；此两组间无差异(P＞0.05)；Ad-CD/5FC组为40.8天，Ad-GM-CSF组为46.2天，此两组与对照组或病毒对照组相比，均有明显延长（P＜0.05）；Ad-CD/5FC联合Ad-GM-CSF组有2只长期存活，余3只平均存活期为57.3天。可见红白血病小鼠经联合基因治疗后，存活期明显延长，与其余各组比较，均有显著差异(P＜0.05)
图2 Ad-CD/5FC和(或)Ad-GM-CSF体内联合注射
对红白血病小鼠存活期的影响
3 体内联合基因治疗后红白血病小鼠肿瘤组织的病理学改变 Ad-CD/5FC联合Ad-GM-CSF组小鼠肿瘤组织表现为大片的肿瘤坏死，坏死组织周围有大量的炎性细胞浸润，以中性粒细胞为主，瘤周有大量单核细胞浸润；Ad-CD/5FC组有肿瘤组织的坏死，但仍有大量具有增殖能力的细胞，炎性细胞浸润不明显；Ad-GM-CSF组可见部分肿瘤组织的坏死及大量中性粒细胞的浸润；PBS对照组及对照腺病毒组(Ad-LacZ/5FC)肿瘤坏死不明显且可见生长状态良好的肿瘤结节(附表)。
4 体内联合基因治疗后红白血病小鼠CTL活性的改变 如图3所示，红白血病小鼠经不同治疗后，PBS对照组和对照腺病毒Ad-LacZ/5FC组小鼠脾细胞的CTL活性较低，经Ad-CD/5FC治疗的小鼠脾细胞CTL活性升高不明显（P＞0.05）。但荷瘤小鼠经Ad-GM-CSF或Ad-CD/5FC联合Ad-GM-CSF治疗后小鼠脾细胞CTL对FBL-3的杀伤活性显著提高(P＜0.05)。
附表 CD自杀基因和（或）GM-CSF基因联合
转移后红白血病小鼠肿瘤的病理学
| 组别 |
肿瘤
坏死 |
坏死区炎性
细胞浸润 |
瘤内炎性
细胞浸润 |
瘤周炎性
细胞浸润 |
| PBS |
- |
- |
- |
- |
| Ad-LacZ/5FC |
- |
- |
- |
+ |
| Ad-CD/5FC |
+++ |
+ |
+ |
+ |
| Ad-GM-CSF |
++ |
++ |
+++ |
++ |
| Ad-CD/5FC
/Ad-GM-CSF |
+++ |
+++ |
+++ |
+++ |
肿瘤坏死：－ 表示无坏死，＋ 表示坏死占肿瘤面积1/3以下，＋＋ 表示坏死占肿瘤面积1/3～2/3，＋＋＋表示坏死占肿瘤面积2/3以上
炎细胞浸润：－无浸润，＋少量，＋＋中等量，＋＋＋大量
图3 白血病小鼠经Ad-CD/5FC和(或)Ad-GM-CSF
治疗后脾细胞CTL活性
讨 论
表达CD基因的肿瘤细胞可将无毒性的5FC转化成具有细胞毒作用的5FU，而导致对这些肿瘤细胞的杀伤。当瘤体中仅有2%的肿瘤细胞表达CD基因时，用无毒性剂量的5FC治疗荷瘤小鼠即可发挥旁观者效应使整个瘤体显著消退。但是单独应用自杀基因，如CD/5FC系统不能非常有效地激发机体的抗肿瘤免疫反应，治疗后肿瘤细胞死亡不彻底并易复发［5］。本实验中单独应用Ad-CD/5FC组，虽然病理切片中可观察到部分肿瘤细胞的坏死及荷瘤小鼠肿瘤生长的相对抑制(与PBS、Ad-LacZ/5FC对照组相比，有显著差异)，但未观察到荷瘤小鼠肿瘤的完全消退及机体免疫功能的明显提高。停止用药后，残存肿瘤细胞持续生长，最终导致荷瘤小鼠的死亡。
细胞因子的免疫基因治疗亦是近年来肿瘤生物治疗的研究热点之一。将细胞因子基因转导入白血病细胞，可提高其免疫原性，降低其致瘤性，接种于具有免疫能力的动物体内，可以诱导机体的抗肿瘤免疫应答。Dranoff等［6］研究表明，GM-CSF在肿瘤局部高效分泌能有效地激活抗原提呈细胞共刺激分子B7的表达，加强了免疫细胞对肿瘤抗原的识别，GM-CSF基因修饰的肿瘤细胞在动物体内引发了CD4+，CD8+细胞依赖的强烈、持久的特异性抗肿瘤免疫反应。重组GM-CSF对小鼠红白血病细胞FBL-3具有诱导分化和凋亡的作用［7］。我们以往的研究工作表明，将转移细胞因子如IL-2、IL-6等基因的灭活白血病细胞或其他肿瘤细胞作瘤苗可以诱发机体强大的抗肿瘤免疫，具有显著的抗肿瘤作用［8～10］，本实验中应用Ad-GM-CSF基因直接瘤体内注射，结果显示荷瘤小鼠肿瘤的生长受到一定的抑制，病理结果表明在瘤周及瘤体内有大量的中性粒细胞浸润，并在中性粒细胞浸润处可见部分肿瘤细胞的死亡。机体免疫功能检测发现荷瘤小鼠CTL杀伤活性有一定的提高(与PBS、Ad-LacZ/5FC对照组相比，有显著差异)。单用细胞因子基因进行肿瘤的基因治疗，虽可激发机体的抗肿瘤免疫，但对肿瘤细胞的直接杀伤作用不强，可暂时减缓肿瘤的生长，相对延长荷瘤小鼠的生存期，但不能彻底消除肿瘤［11］。
本实验中联合应用CD基因及GM-CSF基因治疗小鼠红白血病，结果提示小鼠FBL-3皮下肿瘤的生长明显受到抑制，2/5的小鼠肿瘤消失,长期存活，另外3只荷瘤小鼠的生存期明显长于其它4个组的荷瘤小鼠。体内免疫功能检测表明，经联合基因治疗的小鼠脾细胞CTL杀伤功能明显提高(P＜0.05)。提示联合基因治疗可明显地诱导机体产生抗肿瘤细胞免疫反应。Chen等［12］发现联合转移胸苷激酶tk基因和IL-2基因可显著减少肿瘤的转移。本实验结果表明自杀基因与细胞因子GM-CSF基因联合转移，既纠正了单用自杀基因不能增强免疫功能的缺陷，又改善了单用细胞因子治疗直接抗肿瘤作用不强的弊端，是白血病基因治疗的一条新的有效途径。
参 考 文 献
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(收稿：1997-10-16 修回：1998-02-20)
(校对：张吉贤)
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