hCG-PLZF-RARA转基因小鼠发生慢性粒细胞样白血病

中华肿瘤杂志 2000年第1期第22卷 基础研究

作者：孟秀琴　成国祥　王龙　金晓龙　熊树民　陈国强　蔡循　贾培敏　陈赛娟

单位：孟秀琴（上海第二医科大学附属瑞金医院上海血液研究所，200025）；成国祥（上海第二医科大学附属瑞金医院上海血液研究所，200025）；王龙（上海第二医科大学附属瑞金医院上海血液研究所，200025）；金晓龙（上海第二医科大学附属瑞金医院上海血液研究所，200025）；熊树民（上海第二医科大学附属瑞金医院上海血液研究所，200025）；陈国强（上海第二医科大学附属瑞金医院上海血液研究所，200025）；蔡循（上海第二医科大学附属瑞金医院上海血液研究所，200025）

　　关键词： hCG-PL2F-RNRA；白血病，慢性粒细胞样；转基因小鼠；组织因子

　　【摘要】　目的　为了从整体水平上研究PLZF-RARA融合蛋白的致白血病作用，建立了仅在髓系细胞中表达PLZF-RARA融合基因的转基因小鼠。方法　分子克隆技术构建转基因构件hCG-PLZF-RARA，PCR、RT-PCR、免疫荧光、骨髓象、病理、维甲酸（RA）分化试验等进行检测分析。结果　6只hCG-PLZF-RARA转基因小鼠发生白血病，表现类似人类慢性粒细胞性白血病。组织因子（tissue factor，TF）在融合基因表达阳性的小鼠骨髓细胞中有表达，而在正常小鼠和融合基因表达阴性的小鼠的骨髓细胞中不表达。结论　PLZF-RARA融合基因的表达在白血病的发生中起着极为重要的作用，TF受PLZF-RARA融合基因表达上调。

hCG-PLZF-RARA transgenic mice develop leukemia resembling human chronic myeloid leukemia

MENG Xiuqin, CHENG Guoxiang, WANG Long, et al.

　　（ Shanghai Hematology Research Institute, Rui Jin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China）

　　【Abstract】　Objective　In order to investigate the leukemogenic potential of PLZF-RARA fusion protein in vivo, hCG-PLZF-RARA transgenic mice were generated, in which PLZF-RARA fusion gene was driven by hCG promoter to express in myeloid cells of mice.Methods　Molecular cloning technology was used to construct hCG-PLZF-RARA gene. The genotype and phenotype of the hCG-PLZF-RARA transgenic mice were analyzed by PCR, RT-PCR, immunofluorescence, morphology of bone marrow (BM) cells, pathology and retinoic acid differentiation assays.Results　Six hCG-PLZF-RARA transgenic mice developed leukemia resembling human chronic myeloid leukemia. TF(tissue factor) was not expressed in BM cells of normal mice nor in mice without the expressed transgene, but it was expressed in mice expessing the transgene.Conclusion　PLZF-RARA fusion protein plays a crucial role in leukemogenesis. TF is up-regulated by PLZF-RARA fusion gene.

　　【Subject words】　hCG-PLZF-RARA; Leukemia, chronic myeloid; Transgenic mice; Tissue factor

　　绝大多数的急性早幼粒细胞性白血病（APL）具有t(15；17），少数病例具有t(11；17）和t(5；17），易位均涉及到17号染色体的RARA基因^［1-4］。t(11；17）染色体易位的结果是出现两种融合基因产物PLZF（promyelocytic leukemia zinc finger）-RARA(retinoitic acid receptor A) 和RARA-PLZF。我们建立了由人类组蛋白酶G（hCG）启动子驱动PLZF-RARA融合基因特异地在小鼠的髓系细胞中表达的hCG-PLZF-RARA转基因小鼠，旨在从动物整体水平上了解PLZF-RARA融合蛋白在白血病发生中的作用，以便从分子水平上了解白血病的发病机制。

　　材料与方法

　　一、hCG-PLZF-RARA转基因小鼠的建立

　　1.构建hCG-PLZF-RARA转基因构件：首先从pCC20质粒经酶切分离得到PLZF-RARA融合基因，因pBLUESK多克隆位点EcorI两侧存在ClaI/NotI位点，故先将PLZF-RARA/EcorI位点经KpnI鉴定方向获得pCC23质粒，然后从pCC23经ClaI和NotI酶切获得PLZF-RARA/ClaI/NotI，与经同样酶切线性化的phCG载体连接，转化，筛选获得pCC68质粒，经SalI和PvuI酶切获得hCG-PLZF-RARA转基因构件。经显微注射法（其间经过受精卵制备，结扎公鼠准备，受体准备，显微注射，胚胎移植）获得G0代小鼠。

　　2.整合检测：剪取G0代鼠尾约1 cm，用蛋白酶K（200 μg/ml）消化，55℃过夜，等体积平衡酚-氯仿抽提得到基因组DNA，用DNA-PCR法对G0代小鼠整合检测，PLZF引物序列：GTCGAGCTTCCTGATA-ACGA；RARA引物序列：TGCAGTTCTTGTCCCGGTGA。反应条件：95℃变性5 min, 94℃变性1 min,57℃退火1 min,72℃延伸1 min,35个循环，72℃延伸10 min。取反应产物走2%琼脂糖电泳胶，在紫外灯下观察，摄片后，凝胶经变性液（1.5 mol/L NaCl和0.5 mol/L NaOH）30 min和中性液（1 mol/L Tris-HCL pH 7.4和1.5 mol/L NaCL）45 min后，转移到尼龙膜，经20 h后80℃干烤1 h，将与a-³²P-dCTP标记的探针（PLZF-RARA质粒）进行杂交，杂交过夜后，洗膜凉干后进行放射自显影，-80℃，2 h。

　　二、RT-PCR检测融合基因和组织因子（TF）的表达

　　用PBS冲洗小鼠股骨收集骨髓细胞，加TRIZOL试剂混匀（Gibco公司），氯仿抽提一次，异丙醇沉淀，70%乙醇洗涤，凉干后，加0.1%DEPC水溶解RNA，得到细胞总RNA，紫外分光光度计对RNA定量和测260 nm和(或)280 nm的吸光度值(A值，曾称光密度OD值)鉴定其纯度，电泳判断其完整性。RT-PCR过程按SUPERSCRIPTII试剂盒进行（Gibco公司），第一步取2 μg RNA逆转录反应（RT），第二步取1/10的RT产物进行PCR反应，用管家基因G3PDH作为内参，引物序列1：CAGCTCCAACAGAAGCAGC；引物序列2：CAATGAGCTGCTGTCAGCA；G3PDH引物序列1：CTCCACTCACGGCAAATTCA；G3PDH引物序列2：GCTTCACCACCTTCTAGATG；TF引物序列1：TCAGTTCATGGGGACGGAGA；TF引物序列2：GCGCTTGCACAGAGATATCTG，反应条件：95℃变性5 min，94℃变性1 min,57℃退火1.5 min,72℃延伸1.5 min,35个循环，72℃延伸10 min。取反应产物走2%琼脂糖电泳胶，在紫外灯下观察并摄片。

　　三、免疫荧光

　　用PBS冲洗小鼠股骨收集骨髓细胞，PBS洗涤1次后，用细胞涂片仪涂片凉干后，4%多聚甲醛固定，100%甲醇再固定，1%BSA封闭1 h，加1∶400兔抗人的PLZF抗体，37℃1 h，加1∶10羊抗兔的FITC标记的抗体，37℃ 1 h，加0.1%对苯二胺抗淬灭剂，盖上盖玻片，荧光显微镜下观察，每次加试剂前用PBS洗涤3次。

　　四、外周血和骨髓象检查

　　通过眼角采10 μl外周血，用3%醋酸稀释20倍后在显微镜下进行白细胞计数，血液涂片经瑞氏染色后镜下进行分类。用PBS冲洗小鼠股骨收集骨髓细胞，用细胞涂片仪涂片，经瑞氏染色后镜下进行观察。

　　五、流式细胞仪

　　收集骨髓细胞，PBS洗涤1次后，加1 ml PBS混匀计数，至少2×10⁴个/ml，在50～100 ul体积的PBS中加10 μl CD116/CD32BFCRIII/II（0.5 mg/ml）抗体，室温30 min，以封闭非特异性位点，PBS洗涤1次后，加5 μl FITC-CD11b（0.5 mg/ml）和10 μl PE-CD117（0.2 mg/ml）避光室温30 min，PBS洗涤1次后，上流式细胞仪检测。

　　六、ATRA体外药物试验

　　在无菌条件下，用RPMI1640培养液冲洗小鼠骨髓，收集骨髓细胞并计数，分别设置对照组和1 μmol/LATRA，在培养皿内每孔加4×10⁶个细胞，并分别在3 d和5 d收集细胞，进行细胞涂片和流式细胞仪检测。

　　七、病理检查

　　取小鼠的肝脏、脾、腓骨固定在10%福尔马林液中，经HE染色后，显微镜下观察。

　　结果

　　1.hCG-PLZF-RARA转基因小鼠的建立:获得了在hCG基因的5′侧翼区和第一外显子之间插入的PLZF-RARA融合基因的转基因构件，全长共8.4 kb,其中PLZF-RARA融合基因为2.6 kb。对104只hCG-PLZF-RARA的转基因小鼠即G0代通过基因组DNA进行PCR整合检测，结果51只PCR产物经电泳后出现373 bp的条带，其余的未出现条带，PCR反应产物经southern blot后，发现PCR检测假阳性4只，假阴性为0，整合阳性率为45%。47只G0代阳性小鼠与正常同品系小鼠交配得到F1代，即每个G0代的后代为一单系，共获得20个单系，对20个单系的F1代进行PCR整合检测，发现8个单系的F1代整合检测均阴性。

　　2．转基因小鼠的PLZF-RARA融合基因的表达：收集12个单系中的F1代的骨髓细胞，用RT-PCR方法检测PLZF-RARA融合基因的表达情况。试验设置正常作为阴性对照，设置管家基因G3PDH作为内参。设计的一对引物跨越一个外显子，并且用RNA不经逆转录直接作PCR以排除DNA污染可能。结果12个单系的RT-PCR产物经电泳后均出现了641 bp的条带，说明内参G3PDH均表达阳性，而其中8个单系的还出现了253 bp的条带，另4个单系未出现，说明8个单系的融合基因表达阳性，4个表达阴性。RT-PCR表达阳性的骨髓细胞涂片，用抗PLZF抗体经免疫荧光发现荧光信号出现在细胞核内，而正常小鼠的骨髓(BM)细胞涂片却无荧光信号，说明融合蛋白在细胞核内表达。

表1　发病小鼠和正常小鼠的外周血骨髓象比较

　　注：白细胞总数的单位为×10⁹/L；其余的数值均为% 　　3．hCG-PLZF-RARA转基因小鼠发生类似人类的慢性粒细胞性白血病：对频死小鼠进行外周血，骨髓象，病理（肝、脾、骨）检查，结果发现发病小鼠的外周血、骨髓象和病理表现类似人类的慢性粒细胞性白血病。观察还发现，发病小鼠有2个不同时期，5只转基因小鼠在1～3个月内发病，而1只转基因小鼠在11个多月发病，称之为早期发病和晚期发病。由于早期发病死亡突然，故发现时有的已死，仅靠病理确诊。 结果见表1，2。

表2　发病小鼠和正常小鼠主要脏器的病理比较

　　4．发病小鼠的骨髓细胞体外对1 μmol/LATRA不敏感：发病小鼠的骨髓细胞体外进行原代培养，培养到3 d和5 d时收集细胞进行细胞形态观察和分类计数，流式细胞仪检测细胞分化抗原(CD117在早期细胞表达，CD11b在较成熟的粒细胞表达)。结果3 d和5 d时形态分类计数显示对照组未成熟粒细胞分别是20%和24%，成熟粒细胞分别是80%和76%，而用药组未成熟粒细胞分别是19.3%和24.4%，成熟粒细胞分别是80.7%和73.6%,尽管3 d时原始细胞比0 d时要少，这由于在体外细胞培养时原始细胞有一定的分化能力，5 d时原始细胞比3 d时多，这由于5 d时成熟细胞数相对少，但发现在同一天时用药组和对照组差异无显著性，在BM细胞表型显示用药组和对照组差异也无显著性，说明它对1 μmol/LATRA不敏感。

　　5．PLZF-RARA的转基因小鼠骨髓细胞的组织因子 (TF）表达:RT-PCR方法检测小鼠骨髓细胞的TF表达情况，结果显示正常小鼠和融合基因表达阴性的小鼠的RT-PCR产物电泳后未出现507 bp条带，而在融合基因表达阳性的小鼠的RT-PCR产物电泳后出现507 bp条带，说明骨髓细胞的TF受PLZF-RARA融合基因表达上调。讨论

　　我们建立的转基因小鼠体内PLZF-RARA融合基因是受hCG启动子的调节，hCG是在早幼粒细胞中特异性表达^［5］。观察发现，hCG-PLZF-RARA转基因小鼠有两个不同的发病时期，有早期发病（1～3个月）和晚期发病（11个月），而国外报道hCG-PLZF-RARA转基因小鼠发病时间6～18个月^［6］，导致这种发病时间的差异，可能由于转入的基因插入位点有差异，或者插入位点的其他基因也激活了PLZF-RARA基因的表达或者影响了插入位点的重要基因，这样使得体内细胞得到再次打击，加速了白血病的发生，还有一种可能性是小鼠本身由于个体差异所致。晚期发病的小鼠要经过一段潜伏期后发生白血病，提示有可能PLZF-RARA融合基因表达是必要的，但不足以引起明显的白血病存在，需要有另外的突变发生，在人类有可能存在RARA-PLZF表达而更促进白血病的发生^［7］。

　　值得注意的是，PLZF-RARA融合蛋白引起的白血病，表现类似人类的慢性粒细胞性白血病（CML），这与国外报道一致^［6］，造成这一表型的可能解释是在人类伴t（11；17）的APL中，存在着PLZF-RARA和RARA-PLZF两种转录本，而RARA-PLZF具有RARA的A和(或)B区和PLZF的7个锌指结构。有研究显示，该蛋白激活了含有一个PLZF反应元件的启动子的转录，能使PLZF的靶基因表达失调，从而可能有助于白血病的形成^［7］。而在hCG-PLZF-RARA转基因小鼠中，只有PLZF-RARA一种转录本。另外的一个可能性是， hCG-PLZF-RARA转基因小鼠的PLZF-RARA融合基因表达是受hCG基因的启动子调节的，而在人体内却是由PLZF启动子调控的，这导致了PLZF-RARA融合基因表达的时空不同，引起不同的白血病表型。当然这些假设还有待于进一步实验证实。

　　体外用药显示，发生白血病的小鼠骨髓细胞体外加药培养后发现，对10^-6ATRA不敏感，这与人类伴t（11；17）的APL对ATRA不敏感是一致的，目前认为可能的机制是在正常生理情况下，生理剂量的RA能解除RARA-RXR与共抑制剂的复合物，且吸引共激活剂与RARA-RXR形成复合物，从而使RARA-RXR的靶基因表达，促使细胞的分化和生长抑制。PLZF-RARA中的RARA仍能与共抑制剂结合，而PLZF的POZ功能域也能与共抑制剂结合，药理剂量RA只能解除RARA与共抑制剂的复合物，不能解离PLZF-RARA与共抑制剂结合的复合物，从而仍不能解除转录抑制^［8］。

　　本研究发现，融合基因表达阳性的转基因小鼠的骨髓细胞中TF表达，而在正常小鼠和融合基因表达阴性的小鼠的骨髓细胞中TF不表达，说明TF可能受PLZF-RARA融合基因表达上调，而骨髓细胞中TF的异常表达可能是APL并发症DIC发生的原因之一。

　　本研究结果表明，PLZF-RARA融合基因的表达在白血病的发生中起着极为重要的作用，但由于体内还存在着RARA-PLZF融合基因的表达，所以如果将来有可能把PLZF-RARA和RARA-PLZF融合基因共同转入小鼠体内，也许更能阐明t（11；17）所致白血病的发生。

　　作者单位：贾培敏（上海第二医科大学附属瑞金医院上海血液研究所，200025）

　　陈赛娟（上海第二医科大学附属瑞金医院上海血液研究所，200025）

　　参考文献：

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收稿日期：1999-01-18