阵发性睡眠性血红蛋白尿症患者T淋巴细胞对造血祖细胞的影响

中华血液学杂志 1998年第10期第19卷 论　　著

作者：高清平　夏虹　陈友华　李秀珍　陈济民

单位：（430060　武汉，湖北医科大学附属第一医院血液科）

　　关键词： 血红蛋白尿,阵发性；T淋巴细胞；造血干细胞

　　摘要　目的：研究阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)患者的T淋巴细胞对造血祖细胞的影响。方法：将PNH患者外周血制备的植物血凝素刺激的T淋巴细胞条件培养液(PHA-TCM)加入造血祖细胞的培养基中，用于PNH患者和正常人骨髓的粒-巨噬细胞系集落形成单位( CFU-GM)和红系爆式集落形成单位(BFU-E) 的培养。结果：在含有初发PNH患者的PHA-TCM培养条件下，PNH患者和正常人骨髓CFU-GM和BFU-E数明显低于含有正常人PHA-TCM培养条件下的集落数；在含有好转和治愈的PNH患者的PHA-TCM培养条件下，正常人骨髓CFU-GM和BFU-E数增加和恢复到正常范围。结论：初发PNH患者的T淋巴细胞对造血祖细胞的支持作用减弱，治愈的PNH患者的T淋巴细胞对造血祖细胞的支持作用恢复正常。

　　 Effect of T-lymphocytes on hematopoietic progenitors in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria　Gao Qingping,Xia Hong,Chen Youhua,et al. Department of Hematology,The First Affiliated Hospital, Hubei Medical University,Wuhan　430060

　　 　　Abstract　Objective:To study the effect of T-lymphocytes on hematopoietic progenitors in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria(PNH).Methods:Phytohemagglutinin-stimulating T-lymphocytes conditioned medium(PHA-TCM) prepared from PNH(PHA-TCM-PNH) and normal blood(PHA-TCM-N) was added to the cultures of PNH or normal CFU-GM and BFU-E.Results:In cultures containing PHA-TCM-PNH prepared from newly diagnosed PNH patients,the yields of CFU-GM and BFU-E from either PNH or normal bone marrow were reduced more than they did in cultures containing PHA-TCM-N;but in cultures containing PHA-TCM-PNH prepared from PNH patients in remission,they were normal.Conclusion:T-lymphocytes from newly diagnosed PNH patients exerts an inhibitory effect on the in vitro growth of CFU-GM and BFU-E.

　　 　　Key words　Hemoglobinuria,paroxysmal　　T-Lymphocyte　　Hematopietic stem cells

　　阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种获得性溶血性贫血，其特征是红细胞对补体介导溶血的敏感性增加。这种异常的敏感性是由于缺乏糖化磷酸酰肌醇锚蛋白所致。这种缺陷亦见于T淋巴细胞^［1］。我们应用造血祖细胞培养方法研究了PNH患者T淋巴细胞对粒系祖细胞和红系祖细胞的影响。

病例和方法

　　1　研究对象　PNH患者14例，男、女各7例，年龄14～60岁，平均年龄40岁。PNH的诊断及疗效按全国标准^［2］。所有的PNH患者有溶血并伴有血红蛋白尿，治疗采用雄激素和肾上腺皮质激素。正常对照14名，男、女各7名，年龄16～58岁，平均年龄38岁。

　　2　植物血凝素刺激的T淋巴细胞条件培养液(PHA-TCM)的制备　抽取PNH患者和正常人外周血，肝素抗凝，淋巴细胞分离液(d=1.077,上海试剂二厂生产)分层，取单个核细胞经伊思柯夫改良培养液(IMDM,购自Sigma公司)洗2次后，制成细胞浓度5×10⁶/ml的单个核细胞悬液，加入10%的小牛血清，置培养皿中，37℃孵育30分钟，收获非贴壁细胞，洗1次，制成1×10⁷/ml的细胞悬液，与含20%的胎牛血清(购自Sigma公司)的IMDM液和1×10⁹/ml的神经氨酸酶(购自Sigma公司)处理的绵羊红细胞(1∶1∶2)混合，37℃置15分钟，2?000r／min离心2分钟，混匀后再离心，置4℃1小时，混匀，淋巴细胞分离液分层，去上清液及中间细胞，沉淀部分用0.83%NH₄Cl-Tris液1ml，置5分钟，用培养液洗6次后制成T淋巴细胞悬液^［3］。把T淋巴细胞加入培养体系中。培养体系含1mg/L的植物血凝素(PHA,购自Gibco公司)，20%的胎牛血清，20万U/L的青霉素,0.2g/L的链霉素，10⁶/ml的T淋巴细胞。配制后置37℃、5% CO₂和饱和湿度中培养7天，收集上清，即为PHA-TCM。分装，4℃保存备用。在粒系和红系祖细胞培养时至少用3份PNH患者或3份正常人的PHA-TCM等量混合。

　　3　造血祖细胞培养

　　3.1　骨髓细胞悬液制备： 从髂后上棘抽取骨髓，肝素抗凝，过4号针头去骨髓颗粒，以IMDM稀释淋巴细胞分离液分层，取单个骨髓细胞层，洗3次后制成骨髓细胞悬液，用于粒-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)和红系爆式集落形成单位(BFU-E)的培养。

　　3.2　CFU-GM培养：采用修改的甲基纤维素方法^［4］。培养体系含20%胎牛血清(购自Sigma公司)，0.8%甲基纤维素(购自Sigma公司)，10%PHA-TCM，10⁵/ml的骨髓细胞，IMDM补足至1ml。配制后加入96孔培养板的培养孔中，每孔0.2ml。在37℃、5%CO₂和饱和湿度中孵育7天，倒置显微镜下计数。40个或40个以上的细胞为1个集落。

　　3.3　BFU-E培养：采用修改的甲基纤维素方法^［5］。培养体系中含20%胎牛血清(购自Sigma公司)，1%牛血清白蛋白(购自Sigma公司)，10^-5mol/L的2-巯基乙醇(购自Sigma公司)，0.8%甲基纤维素(购自Sigma公司)，10%的PHA-TCM，1U/ml的红细胞生成素(Amgen公司生产)，10⁵/ml的骨髓细胞，IMDM补足至1ml。配制后加入96孔培养板的培养孔中，每孔0.2ml。培养条件同CFU-GM培养。培养14天时在倒置显微镜下计数。50个以上的红系细胞为1个集落。

　　4　统计方法　两个样本均数的显著性检验用t检验。

结　　果

　　在含有初发PNH患者PHA-TCM的培养条件下，PNH患者的CFU-GM和BFU-E数分别为39.88±13.53/10⁵细胞(以下集落数均为个/10⁵细胞)和10.19±3.91，明显低于含有正常人PHA-TCM培养条件下的CFU-GM和BFU-E数(分别为86.09±19.98和27.91±7.59，P均＜0.001)。

　　在含有正常对照和初发、治愈、经治疗后好转、经治疗无效的PNH患者的PHA-TCM的培养条件下，正常人骨髓造血祖细胞培养的结果见附表。

附表　在含不同PHA-TCM的培养条件下正常人骨髓

　　造血祖细胞培养结果(个/10⁵细胞,±s)