黄褐斑黑色素细胞 祛斑汤的抑制作用

中医药方网 www.piccc.com 发布时间:2016-09-09
贺倩倩 1 , 李耀耀 1 , 曹毅 2 , 杨晓红 2 , 吴蓓玲 2 ( 1. 浙江中医药大学; 2. 浙江中医药大学附属第一医院)

摘 要: 目的: 研究祛斑汤对 HaCat 细胞、 黑素细胞的抑制作用及对 SCF/C - kit 蛋白表达水平的影响, 探讨 SCF/C - kit 信号通路与黄褐斑发病机制的相关性。方法: MTT 法观察 0、 5、 15、 25、 50、 100 mg/mL 浓度祛斑汤对 HaCat 细胞、 黑素细胞的抑制情况, 选取最佳抑制浓度; 根据最佳抑制浓度, 将 Hacat 细胞分为 1640 培养基组、 0. 03 J/cm 2 UVB 照射组、 15 mg/mL 祛斑汤组、 0. 03 J/cm 2 UVB 照射 +15 mg/mL 祛斑汤组, 黑素细胞分为 MelM -2 培养基组、 0. 03 J/cm 2 UVB 照射组、 25 mg/mL 祛斑汤组、 0. 03 J/cm 2 UVB 照射 +25 mg/mL 祛斑汤组; Western blot 法检测各组 Hacat 细胞 SCF 蛋白表达水平, 各组黑素细胞的 C - kit 受体蛋白表达水平。结果: 祛斑汤呈浓度依赖 性抑制 Hacat 细胞/黑素细胞增殖, 15 mg/mL 时对 Hacat 细胞的抑制效应达到峰值( P <0. 01) , 25 mg/mL 时对黑 素细胞的抑制效应达到峰值( P <0. 01) ; 祛斑汤抑制 Hacat 细胞 SCF 蛋白的表达和黑素细胞 C - kit 受体蛋白的 表达, 并下调 UVB 对 HaCat 细胞、 黑素细胞 SCF、 C - kit 蛋白表达的促进作用。结论: 祛斑汤能有效抑制 Hacat 细 胞、 黑素细胞的增殖, 可能与抑制 SCF/C - kit 信号途径的 SCF、 C - kit 蛋白表达有关。

关键词: 祛斑汤; 黄褐斑; HaCat 细胞; 黑素细胞; SCF/C - kit 信号途径

黄褐斑( Melasma) 是一种获得性色素沉着皮肤病, 临 床以面部对称性黄褐色色素沉着为主要表现, 多见于中青年女性, 易伴有不同程度的月经失调、 烦躁易怒、 失眠等症 状, 给患者带来较大的生活和精神压力。近年来, 本科自拟 祛斑汤治疗黄褐斑取得良好的临床疗效。但是黄褐斑的发 病机理十分复杂, 真正的发病原因尚不十分清楚, 多数学者 认为, 黄褐斑皮肤色素加深主要是由于皮肤中的黑素颗粒 增多引起的 [1 ] , 干细胞因子( stem cell factor SCF) 和 C - kit 受体是其中一对重要的细胞因子, 在黑素代谢中起关键作 用 [2 -4 ] 。研究证明, UVB 照射可以引起皮肤色素沉着, 一 定剂量的 UVB 照射可以促进黑素细胞增殖, 增加黑素合 成 [5 ] 。本研究拟通过观察 UVB、 祛斑汤处理下 Hacat 细胞/ 黑素细胞 SCF 和 C - kit 蛋白的表达情况, 探索祛斑汤治疗 黄褐斑的可能机制。

1 仪器和试剂

1. 1 仪器

超净工作台( 上海净化, 型号: SW - CJ - 2F) 、 CO2 培 养箱( Thermo Forma, 型号: 3111) 、 倒置显微镜( COIC, 型号: XJP -2/3) 、 超纯水仪( Thermo Forma, 型号: EASYpure Ro- Di) 、 电泳仪及电泳槽( BIO - RAD, 型号: PowerPac 系列) 、 凝胶成像系统( BIO - RAD, 型号: Gel DocTM XR) 、 低温高 速离心机( Thermo Forma) 、 低温冰箱( SANYO) 、 电子天平 ( Mettler Toledo, 型号: AL204/01) , 液氮罐( Thermo Forma) 、 细胞培养瓶( Corning) 、 96 孔培养板( Corning) 等。

1. 2 试剂

祛斑汤由柴胡12 g, 当归12 g, 菟丝子15 g, 益母草30 g, 川芎12 g, 丹参30 g, 白茯苓15 g, 白芷6 g, 白僵蚕 9 g, 枸杞 子15 g, 制首乌30 g, 桑白皮12 g 组成, 所需中药成分由浙江 省中医院中药制剂室提供。兔抗人 SCF 抗体( 美国 Pepro- Tech 公司) 、 兔抗人多克隆 β - actin 抗体( 博奥森生物有限 公司) 、 兔抗人 C - kit 抗体( 上海优宁维生物科技有限公 司) 、 生物素标记数二抗( 鼠抗兔 IgG) ( 杭州达文生物有限公 司) 、 1640( hyclone) 、 胎牛血清( 美国 Invitrogen 公司) 、 0.25% 胰酶/EDTA( 美国 Invitrogen 公司) 、 四甲基偶氮唑蓝( MTT) ( 美国 Sigma 公司) 、 BCA 蛋白定量试剂盒( 普利莱基因技术 有限公司) 、 ECL 显色试剂盒( Biological Industries) 。

2 试验方法

2. 1 Hacat 细胞/黑素细胞的培养和传代

2. 1. 1 Hacat 细胞的培养和传代 Hacat 细胞的培养液为 含 10%胎牛血清的高糖 DMEM 培养液, 将细胞( 本科室长 期保存) 培养于 37 ℃、 5% CO2 恒温饱和湿度培养箱, 显微 镜下观察细胞生长情况, 是否污染, 是否有细胞悬浮等; 待 细胞融合约瓶底 85% ~95%状态时, 吸去瓶内培养液, PBS 洗涤两次, 加入胰酶适量, 37 ℃孵育 5 min, 吸掉胰酶, 加入 2 mL 培养液终止消化, 反复吹打成使贴壁细胞悬浮于培养 基中, 然后转移至 15 mL 离心管, 800 r/min, 离心 5 min, 弃 上清, 加培养液, 反复吹打, 使细胞悬浮均匀, 以 1 ∶ 3 的比 例接种到培养瓶中。温饱和湿度培养箱。

2. 1. 2 黑素细胞的培养和传代 黑素细胞购自美国 scien- cell 公司, 培养液为含有 2. 5% 胎牛血清的 MelM - 2 培养 液, 余处理方式同 Hacat 细胞。

2. 2 Hacat 细胞、 黑素细胞的 UVB 处理 将对应组细胞用 30mJ/cm 2 UVB 预照射 30 min 后再用 不同浓度祛斑汤提取液处理。

2. 3 药物的配制和贮存

祛斑汤: 取祛斑汤中药成分加相当于药材量 10 倍的蒸 馏水浸泡 2 h, 第一次回流提取 1. 5 h, 滤过后药渣再加 10 倍量水继续提取 1 h, 合并 2 次滤液, 于水浴上浓缩定容至 每 mL 相当于原方生药材 1 g 的药液, 离心去渣, -20°冰箱 低温保存。

2. 4 检测 Hacat 细胞、 黑素细胞增殖

2. 4. 1 Hacat 细胞 先检测能使 Hacat 细胞增殖的祛斑汤 的最佳浓度。将 Hacat 细胞以1 ×10 5 /mL 的密度种植于96 孔板, 每孔 100 μL, 分为 0、 5、 10、 25、 50、 100 ng·mL -1 5 组, 每组6 个复孔, 置于5%CO 2 、 37 ℃恒温培养箱中培养24 h, 待细胞铺满培养孔底部60% ~70%时, 吸除培养液, 用 PBS 冲洗两次, 分别加入用 PBS 配成的 0、 5、 10、 25、 50、 100 ng· mL -1 的祛斑汤, 继续培养 24 h 后吸除培养液, 每孔加入 20 μL 用 PBS 配成的 MTT( 5 mg·mL -1 ) , 放置于 5% CO 2 、 37 ℃恒温培养箱中3 h, 去培养液, 加入150( lDMSO 后震荡10 min, 置于酶标仪 570 nm 读取吸光度值, 比较各组 OD 值, 选取最佳浓度。

2. 4. 2 黑素细胞 黑素细胞的增殖检测同 Hacat 细胞。

2. 5 Hacat 细胞、 黑素细胞的 SCF/C - kit 蛋白检测 设立 DMEM 培养基组、 0. 03 J/cm 2 UVB 照射组、 15 mg/ mL 祛斑汤组、 0. 03 J/cm 2 UVB 照射 +15 mg/mL 祛斑汤组, 取对数生长期 Hacat 细胞, 待细胞铺满培养瓶 70%时, 根据 分组对其进行处理, 继续培养24 h。吸除培养液, 用 PBS 冲 洗两次; 细胞刮刷刮瓶底细胞, 然后用移液器将细胞碎片转 移至 1. 5 mL EP 管中, 4 ℃、 12 000 r/min、 5 min 离心, 弃上 清; 每个 EP 管加入 300 μL RIPA 细胞裂解液, 冰上均匀裂 解 30 min; 裂解完成后用 BCA 法测定蛋白浓度。根据所测 蛋白浓度, 计算 40 μg 溶液蛋白的体积为上样量。将 40 μg 样品蛋白 SDS - PAGE 电泳后转印至 PVDF 膜上, 封闭后加 入相应的一抗( 用 5% 脱脂奶粉封闭液稀释过的 SCF、 β - actin 抗体, 稀释度为 1 ∶ 1000) , 4 ℃过夜孵育。一抗反应结 束后, 用 1 × TBST 在摇床上室温洗 3 次, 每次 10 min; 再加 入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗 ( 稀释度为 1 ∶ 1000) , 室温孵育 2 h, 二抗孵育结束后用 1 × TBST 在摇床 上室温洗 3 次, 每次 10 min; 最后用 ECL 试剂盒显影拍照。 再用同样的方法检测黑素细胞的 C - kit 蛋白表达。

2. 6 数据统计

计量资料以 珋 x ± s 表示; 使用 SPSS 17. 0 软件进行统计, 组间比较采用 t 检验, 相关性采用 Pearson 分析, P≤0. 05 为 差异有统计学意义; 采用 SDS 软件、 Biorad 软件、 GraphPad Prism 5. 0 进行数据图像处理。

3 结果

3. 1 不同浓度祛斑汤对 Hacat 细胞增殖的影响 MTT 法检测不同浓度祛斑汤对 Hacat 细胞增殖的影响 结果显示, 对照组 OD 值最高, 其他不同浓度祛斑汤 OD 值 均低于对照组; 5 mg/mL 的祛斑汤即可抑制 HaCat 细胞增 殖, 15 mg/mL 祛斑汤的抑制效应基本达到最大值( P < 0. 01) , 当浓度 >15 mg/mL 时, 显微镜下可见 Hacat 细胞坏 死、 脱落, 浓度越高, 细胞坏死脱落越明显。见图 1。



祛斑汤组黑素细胞 C - kit 蛋白表达情况, 与培养基组相 比, UVB 能促进黑素细胞 C - kit 蛋白表达, 祛斑汤明显抑 制细胞 C - kit 蛋白表达, 同时抑制 UVB 促进黑素细胞 C - kit 蛋白表达能力。本实验重复 3 次, 结果相似。见图 4。

4 讨论

黄褐斑, 中医认为与肝、 脾、 肾三脏密切相关, 主要病机 为气滞血瘀、 肝肾不足、 脾虚湿停等。肝主藏血、 疏泄调达, 疏泄功能失常, 气机不畅, 郁而气滞, 气滞则血瘀; 肝藏血、 肾藏精, 肾阴不足, 精血亏虚, 虚火上炎, 火燥熏蒸颜面成黑 斑; 胃主受纳, 脾主运化, 脾胃虚弱, 水谷精微化生失常, 水 饮停滞, 气血不和, 不能上荣于皮肤, 发为黄褐斑 。《外科 证治全书·面部证治·面尘》 云 : “面色如尘垢, 日久煤黑, 形枯不泽。或起大小黑斑, 与面肤相平。由忧思抑郁, 血弱 不华。外用玉容散, ……内宜疏胆气兼清肝, 加味归脾汤送 六味地黄丸主之……” 。

本科观察了祛斑汤联合还原型谷胱甘肽静滴治疗 135 例黄褐斑患者, 有效率高达 84. 5%, 明显高于口服维生素 E、 维生素 C、 胱氨酸的对照组 [6 ] 。祛斑汤由柴胡 12 g, 当归 12 g, 菟丝子 15 g, 益母草30 g, 川芎12 g, 丹参30 g, 白茯苓 15 g, 白芷6 g, 白僵蚕9 g, 枸杞子15 g, 制首乌30 g, 桑白皮 12 g 组成, 临床上用于黄褐斑治疗, 疗效明确。本方柴胡疏 肝理气, 川芎、 当归、 丹参、 益母草养血活血, 白茯苓、 桑白 皮、 白芷、 白僵蚕健脾理湿、 祛风利水, 菟丝子、 枸杞子、 制首 乌补益肝肾, 滋阴养血, 全方共奏疏肝解郁, 补肝益肾, 调和 气血, 活血化瘀之功。陈仁康发现化瘀消斑汤配合外用洗 面方治疗黄褐斑有明显效果, 有效率达 85% [7 ] 。杜柯 [8 ] 的 研究指出柴胡内含有丰富的柴胡多糖, 具有良好的抗衰老、 抗氧化作用; 张建华等 [9 -10 ] 研究表明白芷, 白茯苓、 当归、 川芎、 白僵蚕的萃取物对酪氨酸酶有不同的抑制作用; 应军 等 [11 ] 指出丹参提取液能提高机体抗氧化能力, 抑制 TYR 活性, 减少黑色素的合成以及改善机体的血液流变学, 达到 防治黄褐斑的功效。

中医药治疗黄褐斑在临床上取得了一定的疗效, 但也 存在一些难题。国内对于中医药治疗黄褐斑的研究多局限 在病案分析、 专家经验报告等回顾性研究, 缺乏对其病因病 机的前瞻性研究。西医认为人类皮肤色素沉着过程主要为 成熟的黑素小体合成黑素, 黑素小体向树突远端转移、 传递 至邻近角质形成细胞, 然后在角质形成细胞内分布和降解。 在这一过程中, 黑素颗粒合成增多、 黑素颗粒从黑素小体向 邻近角质形成细胞转运减少及角质形成细胞新陈代谢下降 都有可能引起皮肤中黑素颗粒的增多, 但其真正的机制尚 未明确。Hachiya 等发现经 UVB 照射后, 培养的角质形成 细胞和黑素细胞的 SCF 和 C - kit 受体的基因水平和蛋白 水平量均显著增加; 阻断 SCF/KIT 途径后, 紫外线照射不 再引起豚鼠皮肤黑素细胞增加。潘建英等 [5 ] 实验研究发 现 0 ~0. 06 J/cm 2 UVB 能激活酪氨酸酶和促进黑素细胞的 黑素合成。这些实验结果都说明了 SCF/KIT 途径在紫外 线引起黑素细胞增生、 色素沉着中的关键作用。

本实验通过研究祛斑汤对 HaCat 细胞/黑素细胞的抑 制作用及对 SCF/C - kit 蛋白表达水平的影响, 发现祛斑汤 呈 浓度依赖性抑制Hacat细胞 /黑素细胞增殖, 15mg /mL 时对 Hacat 细胞的抑制效应达到峰值( P < 0. 01) , 25 mg/ mL 时对黑素细胞的抑制效应达到峰值( P <0. 01) , 且抑制 Hacat 细胞 SCF 蛋白的表达和黑素细胞 C - kit 受体蛋白的 表达, 并下调 UVB 对 HaCat 细胞/黑素细胞 SCF、 C - kit 蛋 白表达的促进作用。由此, 笔者推测祛斑汤治疗黄褐斑的 机制可能与 SCF/C - kit 信号通路有关, 本实验为其临床治 疗黄褐斑提供了有力的实验依据。

参考文献

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