¹³¹I-抗CEA单抗防治大肠癌根治术后肝转移的实验研究

中华核医学杂志 2000年第5期第20卷 论著

作者：黄平　周锡庚　朱承谟　江旭峰

单位：黄平（310022　杭州,浙江省肿瘤医院大肠癌科）；周锡庚（上海第二医科大学附属瑞金医院外科）　朱承谟（核医学科）　江旭峰（核医学科）

　　关键词： 抗体，单克隆；癌胚抗原；肠肿瘤；肝肿瘤，实验性；肿瘤转移；放射免疫疗

　　【摘要】　目的　探讨¹³¹I-抗癌胚抗原(CEA)单抗防治裸鼠体内人结肠癌细胞肝转移的效果。方法　裸鼠脾内注入人结肠癌细胞后、脾切除后第4或第8 d腹腔注射¹³¹I-抗CEA单抗,观察术后生存时间,并对肝脏进行组织学检查。结果　术后第4或第8 d注射¹³¹I-抗CEA单抗均显著延长裸鼠术后生存时间;术后第4 d注射可使肝转移率减少33.3%,第8 d注射不能使肝转移率减少。结论　术后早期行放射免疫治疗可取得较好的治疗效果,放射免疫治疗尤其适合于肝微小转移癌的治疗。

Experimental study in the prevention and therapy of liver metastases after curative resection of colorectal cancer with ¹³¹　I-(anti-CEA)MoAb

HUANG Ping　ZHOU Xigeng　ZHU Chengmo

　　（Department of colorectal cancer, Zhejiang provincial oncology hospital,Hangzhou 310022, China）

　　【Abstract】　Objective　To investigate the effect of ¹³¹　I-(anti-CEA)MoAb for treatment of human colon cancer cells (HCCC) liver metastases in nude mice. Methods　We gave intraperitioneal injection of ¹³¹　I-(anti-CEA)MoAb on the 4th or the 8th day after intrasplenic injection of HCCC and subsequent splenectomy, then we observed the postoperative survial time of the nude 　mice 　and 　examined 　the 　livers 　pathologically. 　Results　The　¹³¹　I-(anti-CEA)MoAb injected on the 4th or the 8th postoperative day could significantly prolong the postoperative survival time. The incidence of liver metastases was decreased by 33.3% with the injection of ¹³¹　I-(anti-CEA)MoAb on the 4th postoperative day but not on the 8th postoperative day. Conclusions　The study indicates that the early employment of the radioimmunotherapy may be more efficacious for the containment of HCCC liver metastases and this therapy is especially suitable for the treatment of hepatic micrometastases.

　　【Key words】　Antibodies, monoclonal; Carcinoembryonic antigen; Intestinal neoplasms;

　　Liver neoplasms, experimental; Neoplasm metastasis; Radioimmunotherapy

　　大肠癌根治术后约40%的患者发生肝转移,目前尚无有效的防治方法。研究表明:实体肿瘤对抗体的摄取与肿瘤大小呈负相关^［1］,放免治疗的靶位从大块实体肿瘤转移到微小癌可能具有一定意义。本实验采用脾内注入人结肠癌细胞(HCCC)、脾切除的方法建立裸鼠体内HCCC肝转移模型,探索¹³¹I-抗癌胚抗原(CEA)单抗对裸鼠体内HCCC肝转移的早期治疗效果。

　　材料和方法

　　1. 主要试剂和仪器。抗CEA单抗为无锡第二制药厂产品,Na¹³¹I由中国原子能科学研究院同位素所提供,氯胺T为上海试剂一厂产品,Sephadex G25为Pharmacia 公司产品,SN-682 γ计数器为中国科学院上海原子核研究所日环仪器厂产品,DU-68紫外分光光度仪为Bechman公司产品。

　　2. 细胞和动物。HCCC即LoVo细胞由上海市免疫研究所提供,该细胞系由美国引进,原肿瘤源于1例56岁男性结肠癌患者锁骨上淋巴结转移癌切除标本,经体外细胞培养后建系,具有产生CEA的能力^［2］。BALB/c裸鼠,由上海市肿瘤研究所提供。雌雄兼有,鼠龄6周,体重(20±1) g,饲养条件按SPF要求。

　　3. HCCC肝转移模型的建立。按照冯国光等^［2］的方法制备HCCC悬液后,无菌条件下,质量分数为2.5%的戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉裸鼠,取左侧腹2.0～2.5 cm切口进腹。结扎、切断脾胃韧带,将脾脏完全显露于腹腔外。从脾脏上极进针1.0 cm以上,于2组每只裸鼠脾内分别注入HCCC 10⁶(50 μL),注射时间1 min。出针后即用体积分数95%酒精稍浸湿的棉球轻压止血,5 min后结扎、切断脾蒂,移除脾脏,3-0丝线单层间断缝合腹壁。

　　4. 正常小鼠抗体(nmIgG)的提取。取4只BALB/c杂合小鼠(体重16～18 g,皆为雌性),经内眦取血,按文献［3］提取nmIgG。

　　5. ¹³¹I标记抗体的制备。按文献［4］的方法,用氯胺T法进行¹³¹I标记抗体(抗CEA单抗和nmIgG)。采用紫外吸收法(280 nm)结合γ计数器测定¹³¹I标记抗体的放射性比活度。纸层析法结合γ计数器测定¹³¹I标记抗体的放化纯度。按Buchsbaum等^［5］的方法,用细胞结合实验测定¹³¹I标记抗体的免疫活性。

　　6. 脾切除小鼠对¹³¹I-nmIgG的最大耐受剂量(MTD)实验。BALB/c小鼠21只［体重(20±1) g、雌雄兼有］,每只小鼠无菌条件下腹腔注射质量分数2.5%戊巴比妥钠(40 mg/kg),麻醉后左侧腹部切口进腹,显露脾脏,结扎、切断脾胃韧带和脾蒂,移除脾脏,间断一层缝合腹壁。术后小鼠随机分3组,各组7只,术后前3 d给予质量分数0.1%KI饮用水,术后第4 d对3组小鼠分别每只腹腔注射¹³¹I-nmIgG 9.25 MBq(0.8 mL)、10.18 MBq(0.8 mL)、11.10 MBq(0.8 mL),观察各组小鼠死亡数。

　　7. 裸鼠脾内注入HCCC,脾切除后肝脏病理检查。裸鼠6只,脾内注入10⁶ HCCC,脾切除后第4及第8 d分别处死3只,对肝脏行大体观察,并将肝脏进行组织切片、HE染色、光镜观察。

　　8. 裸鼠体内HCCC肝转移早期放免治疗实验。分组:脾内注入10⁶ HCCC、脾切除后的裸鼠60只,分为不用药组1组(12只),用药组4组(每组12只)。对用药组裸鼠,用药前3 d给予质量分数0.1%KI饮用水,术后第4或第8 d腹腔注射与小鼠MTD相等的¹³¹I标记抗体。观察方法:观察术后生存时间(＞60 d仍存活的裸鼠则处死),并观察肝、胃、肠、胰、肺等脏器有无转移结节及转移结节分布情况,并对肝脏行组织切片、HE染色、光镜观察。

　　9. 统计学分析。数据采用Student' t检验和秩和检验。

　　结果

　　　1. ¹³¹I标记抗体的鉴定。¹³¹I-抗CEA单抗的比活度为99.16 MBq/mg,放化纯度为98.1%,免疫学活性为54.2%。¹³¹I-nmIgG的比活度为91.02 MBq/mg,放化纯度为97.4%,免疫学活性为2.3%。

　　2. 脾切除小鼠腹腔注射¹³¹I-nmIgG死亡率。脾切除小鼠在腹腔注射¹³¹I-nmIgG后均出现不同程度食欲减退,其中腹腔注射11.10 MBq的7只小鼠中有2只于第6、第7 d分别死亡,尸解检查未见肠穿孔或腹水。其余小鼠均存活,1周后饮食活动逐渐恢复正常。脾切除小鼠对¹³¹I-nmIgG 的MTD为10.18 MBq。

　　3. 裸鼠脾内注入HCCC、脾切除后肝脏病理检查。裸鼠脾内注入HCCC、脾切除后第4 d行尸解,未见肝脏表面有转移结节。对肝脏行组织切片,光镜观察可见微小转移癌。裸鼠脾内注入HCCC、脾切除后第8 d行尸解,见肝脏表面有4～6枚直径约0.15～0.35 cm大小的结节。

　　4. 裸鼠脾内注入HCCC、脾切除后不用药组和用药组术后生存时间观察和肝脏病理检查。术后第4或第8 d腹腔注射10.18 MBq的¹³¹I标记抗体,裸鼠术后生存时间见表1。术后第4 d注射¹³¹I-抗CEA单抗组中有4只裸鼠肝脏经大体观察和组织学检查均未发现转移灶,其余56只裸鼠肝脏有大小不等的转移结节,组织学检查证实为转移癌。对所有裸鼠进行尸解和组织学检查,未发现肝外其他脏器如胃、肠、胰、肺等有转移结节。

　　由表1可见,术后第4 d注射¹³¹I-抗CEA单抗组术后平均生存时间比不用药组及术后第4 d注射¹³¹I-nmIgG组分别延长68.6%、43.2%(P＜0.01)。术后第8 d注射¹³¹I-抗CEA单抗组术后平均生存时间比不用药组、术后第8 d注射¹³¹I-nmIgG组分别延长49.7%、37.3%(P＜0.01)。

表1　注射¹³¹I-抗CEA单抗及¹³¹I-nmIgG对裸鼠各组术后生存时间的影响

　　注:术后生存时间¹³¹I-抗CEA单抗组与不用药组及¹³¹I-nmIgG组相比,t＞78,P均＜0.01;术后平均生存时间¹³¹I-抗CEA单抗组与不用药组及¹³¹I-nmIgG组相比,t＞11.21,P均＜0.01

　　讨论

　　大肠癌根治术后肝转移是导致患者死亡的主要原因。近来有人用5-氟脲嘧啶(Fu)门静脉化疗或腹腔化疗来预防手术后肝转移。但对大肠癌化疗的研究结果表明5-Fu仅对25%的患者有效^［6］。Goldie等^［7］的研究还表明化疗呈指数杀死癌细胞,当癌细胞剩余10³～10⁶时会产生抗药性,经过一段潜伏期会重新增殖。因此,理论上用化疗方法预防大肠癌根治术后肝转移仅能延长部分患者生存时间,很难达到根治目的^［8］。

　　放免治疗对大块肿瘤疗效并不显著。近来的研究表明:实体肿瘤对抗体的摄取与肿瘤大小呈负相关^［1］,其主要原因是随着肿瘤体积的增大,肿瘤内部间质压力增高、血管网相对减少以及可能存在坏死区。因此,人们对放免治疗的靶位有了重新认识,有学者认为放免治疗应针对术后残存或转移而来的微小癌灶^［9］。

　　用裸鼠脾内注入HCCC、脾切除的方法建立的HCCC肝转移模型能很好模拟临床上大肠癌根治术后肝转移征象,免疫组化证实癌细胞膜和细胞浆含有CEA^［10］。本实验在裸鼠脾内注入HCCC、脾切除后第4 d显微镜下可见肝脏转移癌,第8 d肝脏表面已有肉眼可见的转移结节,结节直径大小约0.15～0.35 cm,此结果与冯国光等^［2］的报道类似。由于裸鼠腹腔注射¹³¹I-抗CEA单抗后抗体能在肝脏中很好地聚集^［11］,因此,我们在裸鼠脾内注入HCCC、脾切除后第4及第8 d分别腹腔注射¹³¹I-抗CEA单抗,观察对肝脏中微小转移癌的治疗效果。结果表明:裸鼠脾内注入HCCC、脾切除后早期行放免治疗可取得较好的治疗效果,放免治疗尤其适合于肉眼未见的微小转移癌治疗。

　　参　考　文　献

　　1，Sgouros G. Radioimmunotherapy of micrometastases: sidestepping the solid-tumor hundle. J Nucl Med, 1995, 36:1910-1912.

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　　3，陈陵际, 尤永进, 尹冬梅, 等. 酶联免疫吸附法测定SCID小鼠血清中IgG的含量. 上海实验动物科学, 1997, 17:20-21.

　　4，朱晓明, 王世真, 周前, 等. ¹³¹　I-CEA单克隆抗体在移植人结肠癌裸鼠体内定位. 中华核医学杂志, 1987, 7:20-24.

　　5，Buchsbaum D, Khazaeli MB, Tiepu L, et al. Fractioned radioimmunotherapy of human colon carcinoma xenografts with ¹³¹　I labeled monoclonal antibody cc-49. Cancer Res, 1995, 55:5881s-5887s.

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　　8，Fielding LP, Hittinger R, Grace RH, et al. Randomised controlled trial of adjuvant chemotherapy by portal vein perfusion after curative resection for colorectal adenocarcinoma. Lancet, 1992, 340:50.

　　9，田嘉禾. 关于放免治疗的新思考. 国外医学放射医学核医学分册, 1997, 21:249-252.

　　10，黄平, 楼荣灿, 张学栋. 脾切除法建立裸小鼠人结肠癌肝转移模型. 上海实验动物科学, 1999, 19:137-139.

　　11，李培勇, 朱承谟, 史爱兰. CEA单克隆抗体在裸鼠移植人结肠癌中的放免显像. 中华核医学杂志, 1990, 10:16-17.

(收稿日期:1999-12-06)