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诺维本联合放射对人鼻咽癌离体细胞系的作用

诺维本联合放射对鼻咽癌离体细胞系的作用

中华放射医学与防护杂志 2000年第5期第20卷 基础研究

作者:戴惠芳 张鸿未 陈旭峰 钱丽娟 胡福军

单位:310022 杭州,浙江省肿瘤医院

  诺维本(Navelbine,NVB)是一个半合成的长春花生物碱,主要作用于有丝分裂微管,对轴突微管的神经毒性较小[1],故被认为是有效和安全的抗癌药物。由于其独特的作用机理-阻滞微管蛋白的聚合,我们用鼻咽癌细胞系(CNE)进行了NVB联合放射对细胞离体增殖抑制作用及细胞凋亡的研究,发现两者联合作用能提前引起细胞凋亡,并进一步加速诱导细胞的死亡。

  一、材料和方法

  1.材料:细胞:鼻咽癌细胞系(CNE),上海肿瘤医院放射生物室赠送,RPMI-1640培养液含10%小牛血清,37℃单层贴壁生长。药物:诺维本(Pierre fabre.Co.)照射条件:60Co γ射线,SSD 80 cm,射野35 cm×35 cm,吸收剂量率120 cGy/min。

  2.方法

  (1)药物对细胞的抑制:取对数生长期的CNE细胞,制成单细胞悬液(1×105/ml),10 μl/孔细胞悬液加入到96孔培养板,体积分数为5%CO2孵箱培养24 h后,用无血清培液使细胞同步化,48 h后,换含不同浓度(20、40、60、80、100 μmol/L)药物的培养液、24 h后每孔加10 μl MTT(5 mg/ml)液,继续培养4~6 h后,加100 μl酸化异丙醇中止反应,震荡10 min,酶标仪(Clini Bio 400 ATC)570 nm测量A值,并求其抑制率。

  抑制率(%)=(1-实验组平均A值/对照组平均A值)×100

  (2)药物对细胞作用的时间依赖性

  将3×105/瓶及1×104/孔细胞悬液分别接种到有盖片的25 ml培养瓶及96孔板中,细胞经上述同步化后,分别加入不同浓度(20、60μmol/L)的NVB,培养至4、8、12、24、48、72 h后,分别进行以下各指标检测:①药物对细胞抑制的时间依赖性:用MTT法检测,方法同前。②细胞核分裂指数:在上述不同的时间各取一片盖片固定于95%酒精中,H.E.染色后,高倍镜下计数2000个细胞,计算核分裂指数。③流式细胞术的细胞周期分析:各组按常规的流式细胞术检测法收集并固定细胞;检测前细胞经200 g离心后,倾去上清,按顺序加入A(含胰酶等),B(含胰酶抑制剂及RNase A),C(含PI)液各10 min,(A,B,C液B.D.inc.U.S.A.),流式细胞仪(FACS calibur,B.D.U.S.A.)检测PI标记的细胞核。

  (3)药物联合放射对细胞凋亡的影响

  取对数生长期的细胞,以1×105/ml细胞共3 ml/瓶等量接种在25 ml培养瓶中,细胞按上述同步化后,随机分组:①对照组(C);②单纯放射组(R):一次600 cGy照射;③单纯药物组(N):NVB (20 μm)作用24 h后,置以新鲜培液培养;④药物加放射组(N+R):NVB (20 μmol/L)作用24 h,接着一次600 cGy照射后,置以新鲜培液培养。

  流式细胞术的细胞凋亡分析:经药物及放射处理后0、4、24、48、72 h时,分别收集各组细胞,按上述流式细胞术方法处理并分析各组细胞的凋亡小峰。

  DNA琼脂糖电泳检测:上述在不同时间收集的各组细胞,经PBS洗涤后悬浮于0.1 ml的裂解缓冲液(5 mmol/L Tris-HCl pH 8,0.25% nP-40,1 mmol/L EDTA,10 mg/ml RNase),37℃水浴1 h,再加入蛋白酶K(20 mg/ml)2.5 μl,37℃水浴再孵育1~2 h,结束后取15 μl上样液,在1.5%琼脂糖凝胶上,60 V稳压条件下电泳1.5 h,溴乙啶染色并在紫外透射光源下观察。

  二、结果和讨论

  1.药物对细胞的抑制

  用MTT比色法检测不同浓度(20、40、60、80、100 μmol/L)的NVB对细胞的抑制,作用24 h后,其抑制率分别为6.15、20.8、51.95、76.2和90.9%。ID50为60.71μmol/L。

  2.药物对细胞作用的时间依赖性

  (1)药物对细胞抑制的时间依赖性

  用MTT法检测结果,NVB低浓度(20 μmol/L)时,基本上无明显的抑制作用,而在高浓度时(60 μmol/L)具明显的时间依赖性,见图1。

图1 药物对细胞抑制时间关系

  (2)药物对细胞核分裂指数的影响

  从图2可见,与对照组相比,低浓度的NVB(20 μmol/L)作用至8 h时细胞的核分裂相明显增加,但随着药物持续时间的增加,细胞的核分裂相迅速减少。高浓度的NVB(60 μmol/L)在作用的早期就明显抑制细胞生长。

图2 药物对细胞核分裂指数的影响

  (3)流式细胞术的细胞周期分析

  从流式细胞术的细胞周期分析结果发现(图3),低浓度(20 μmol/L)的NVB作用至12 h后,G2+M相细胞明显高于对照组,综合图2结果分析,NVB(20 μmol/L)主要使该细胞阻滞于G2期,而使G2进入M期的细胞明显减少。在高浓度时(60 μmol/L)主要以不可逆的直接杀伤效应作用于该细胞。

图3 药物对(G2+M)期细胞比例的影响

  (3)药物联合放射对细胞凋亡的影响

  通过高分子量DNA琼脂糖电泳及流式细胞术检测发现,20 μmol/L NVB作用24 h后,继续培养,24 h开始出现DNA 梯状和凋亡小峰,但至48 h DNA 梯状不明显;单纯600 cGy照射后的细胞,至72 h才出现DNA “Ladder”及凋亡小峰,而经NVB (20 μm)作用24 h后再经600 cGy照射的细胞,即刻至72 h均出现DNA 梯状条带及凋亡小峰(见图4、5)。

  各组细胞在不同时间内的平均凋亡 %分别为:C组5.214±4.470,R组6.116±6.663,N组10.07±9.053,(N+R)组17.68±8.967,经统计学分析,(N+R)组与C组和R组相比,P均<0.05。

  我们的研究结果发现,当一定浓度的诺维本作用于CNE细胞24 h后,对细胞生长的抑制呈一定的剂量依赖性关系。从细胞有丝分裂及流式细胞术检测的(G2+M)期细胞的比例发现NVB作用的靶点是G2期,从而进一步证实了NVB致使微管蛋白解聚的作用机理,这与Bine[4]的报道相似。

  由于诺维本主要作用于细胞G2期,故为细胞周期特异性药物,而G2期细胞对射线最敏感,所以二者合用有一定的协同效应,即增强放射线的敏感性。Edelstein[5]等也发现,诺维本能增强射线对小细胞肺癌细胞系(NCI-H460)的敏感性。我们从流式细胞术的细胞凋亡分析结果也发现,单纯诺维本或放射导致的细胞程序性死亡(Apoptosis)都有一定的时间性和局限性,且单纯600 cGy照射后的细胞,至72 h才出现明显的凋亡小峰及DNA梯状条带,而经诺维本联合放射作用后的细胞,即刻至72 h均出现了凋亡小峰及DNA 梯状条带,可见诺维本联合放射能提前引起细胞进入凋亡状态,且这种迅速引起的凋亡诱导作用具有较长的时间延续性,从而最终导致细胞的不可逆死亡,表明在细胞离体生长状态下,诺维本除了诱导细胞生长阻止在G2期,从而增加细胞对放射的敏感性及自身对细胞的凋亡诱导作用外,并能增强辐射对细胞凋亡的诱导作用。

图4 PI-流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡小峰

图5 大分子量DNA琼脂糖电泳结果,

  示DNA“Ladder”的形成

  a.L-1-5示对照组细胞DNA电泳结果 R-1-5示单纯放射后0、4、24、48、72 h细胞DNA电泳结果 b.L-1-5示NVB作用后0、4、24、48、72 h后细胞DNA电泳结果 R-1-5示NVB联合放射作用后0、4、24、48、72 h细胞DNA电泳结果

参考文献

  1,Binet S,Fellous A,Lataste H,et al.In situ analysis of the action of Navelbine on various types of microtubules using immunofluorescence.Semin Oncol,1989,16(Suppl 4):5-8.

  2,Johnson SA,Harper P,Hortobsgyi GN,et al.Vinorelbine:an overview.Can Treat Rev,1996,22:127-142.

  3,张湘如,孙燕.新抗肿瘤药异长春花碱.北京医学,1992,14:168-193.

  4,Binet S,Chaineau E,Fellous A,et al.Immunofluorecence study of the action of Navelbine,Vincristine and Vinblastine on mitotic and axonal microtubules.Int J Cancer,1990,46:262-266.

  5,Edelstein MP,Wolfe LA,Duch D S.Potentiation of radiotherapy by Navelbine (NVB) in human non-small cell lung cancer (NSCLC) line.Proc Am Ass Cancer Res,1995,36:A3637.

(收稿日期:1999-12-11)


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