实验性口腔癌变模型中端粒酶的研究

华西口腔医学杂志 2000年第1期第18卷 专栏论著

作者：毛祖彝　高志　徐平平　左晖　何永文

单位：毛祖彝（华西医科大学口腔医学院　610041）；高志（第四军医大学博士后流动站）；徐平平（华西医科大学口腔医学院　610041）；左晖（华西医科大学口腔医学院　610041）；何永文（华西医科大学口腔医学院　610041）

关键词：癌变； 端粒酶活性； 颊囊

　　摘　要：目的:分析能合成端粒DNA重复序列的端粒酶在DMBA诱导金黄地鼠颊囊癌变动态过程中的动态变化。方法:采用PCR基础上的端粒DNA重复序列扩增法和ELISA酶免疫技术,测定颊囊癌变组织端粒酶动态变化。结果:在诱癌过程中,颊囊粘膜组织端粒酶活性随组织病理学改变向恶性转化而增高,与自身对照相比较有显著差异,其升高在诱癌后期最明显。结论:端粒酶激活是肿瘤形成的早期分子标志,也是端粒长度稳定的主要因素。

Indentification of Telomerase Activity in the Experimental Carcinogenesis of Oral Cavity

Mao Zuyi　Gao Zhi　Xu Pingping, et al

　　（Department of Oral Maxillofacial Surgery, College of Stomatology,West China University of Medical Sciences）

　　Abstract：Objective：Telomerase is a ribonucleoprotien enzyme which synthesizes telomere DNA repeat sequences and maintain stably telomere length. The activity of telomerase may be necessary for the growth of immortalized cells overcoming cellular senescence. The researches have shown that telomerase activities are associated with most cancers. The purpose of the study is to detect the development of telomerase activity during golden hamster cheek pouch carcinogenesis induced by DMBA.Methods: First, 52 golden hamsters were divided into 2 groups. Four of them weren't done any special treatment and were killed after 3 days. The others were covered with DMBA on the surface of cheek pouch on one side in order to induce carcinogenesis, the other side of cheek pouch was treated as the control. Then, the 48 golden hamsters were divided into 4 groups and were killed in 7, 10, 14 and 20 weeks. The telomeric repeat amplification protocol (TRAP) based on PCR and ELISA was used to analysis the activity of telomerase.Results: ①The expression of telomerase activity existed in normal cheek pouch mucosa of golden hamsters, which meant that telomerase played an important role on controlling cell proliferation. ②The level of telomerase activity gradually increased while hyperplasia and dysplasia was observed in the cheek pouch mucosa covered with DMBA. It reached its top at a later premalignant period and gradually decreased after that. ③There was negative correlation between the degree the telomere length was shortened and the activity of telomerase (r=-0.9654), and there was positive correlation between the reduced rate of telomere length and the activity of telomerase (r=0.9471).Conclusion: The activity of telomerase is one of important factors that can effect the stability of telomere length and plays a crucial role in the progression of oral cancer. So the activity of telomerase is an early molecular marker of carcinogenesis.

　　Key words：carcinogenesis telomerase activity cheek pouch▲

　　近年来的研究发现,细胞的增殖与凋亡受染色体末端结构端粒长度控制,当端粒长度缩短到一定时,染色体稳定性降低,可能出现融合、重组甚至分解,导致细胞停止分裂增殖而进入凋亡。而端粒酶是一种能添加端粒DNA重复序列至染色体末端的核糖核酸蛋白酶,它具有类似逆转录酶功能,可以自身RNA为模板合成端粒DNA重复序列,并转接到染色体3′末端,维持端粒长度^［1,2］。研究表明,大多数正常组织和体细胞内端粒酶活性难测到(阳性率仅4%左右)。但端粒酶与恶性肿瘤发生有密切相关性。Kim等^［3］和Counter等^［4］研究报道，112种恶性肿瘤细胞株和肿瘤组织端粒酶活性阳性率高达85％以上。在正常细胞恶性转化中，细胞端粒长度明显缩短，而端粒酶激活使染色体端粒稳定地维持在一定长度，导致恶性转化细胞无限增殖，成为永生不死细胞（immortal cell）。目前对于端粒酶激活以及调控机理还认识不清。1994年Kim等^［3］首次报道了结合PCR技术测端粒酶活性的端粒重复序列扩增法(telomeric repeat amplification protocol，TRAP）,这使测定各种组织端粒酶活性成为可能。本研究首次应用PCR-TRAP法结合ELISA分析法，半定量测定金黄地鼠颊囊癌变过程中的端粒酶动态改变，结合端粒长度变化，分析和了解端粒酶在癌变过程中的作用，并为进一步研究针对端粒酶的肿瘤基因治疗提供一定的实验依据。

　　1　材料和方法

　　1.1　主要试剂与设备

　　二甲基苯并蒽(DMBA,Sigma公司,美国),5′-（CCCTAA)₄-3′寡核苷酸探针(北京赛百盛公司),考马斯亮蓝染料(Sigma公司),端粒酶PCR-ELISA检测药盒（Boehringer Mannheinn公司),GeneAmp PCR 9600 Thermal Cycler(BIO-RAD公司),SHZ-22水浴恒温振荡器(江苏省太仓医疗器械厂),EL312 microplate Bio-Kinetics reader(美国)。

　　1.2　金黄地鼠颊囊癌变动物模型建立

　　用DMBA诱导，参见参考文献［5］。

　　1.3　金黄地鼠颊囊粘膜组织端粒长度测定

　　Southern杂交法参见参考文献［5］。

　　1.4　金黄地鼠颊囊粘膜组织端粒酶活性检测

　　1.4.1　原理 考马斯亮蓝染色确定检测样本含端粒酶蛋白量，利用端粒酶具有逆转录功能，作用其底物（telomerase substrate，TS），合成端粒重复序列TTAGGG，以此作为数目不等的模板，再经PCR循环扩增，放大端粒酶功能活性，用高灵敏度、非放射性的ELISA方法检测PCR产物量，设定阳性和阴性对照,以OD值作比较，判定端粒酶活性。

　　1.4.2　操作步骤 按端粒酶PCR-ELISA检测药盒说明进行，检测样本端粒酶蛋白量确定为1 μg/μl，在EL312e Microplate读数仪上测定OD值，以此判定端粒酶活性。

　　1.5　数据统计学处理

　　所测定的数据,采用t检验和方差分析进行各组差异分析,采用线性回归进行相关分析，检验水准α=0.05。

　　2　结 果

　　2.1　金黄地鼠颊囊癌变过程中端粒酶动态变化观察

　　金黄地鼠颊囊癌变过程中不同时期的端粒酶活性OD值结果见表1。每次检测以药盒提供的阳性对照（胚胎肾细胞株HEK293细胞）和煮沸法产生的阴性对照做ELISA检测显色反应，其OD值分别为：0.580±0.015和0.046±0.00352以此作端粒酶活性阴阳性标准，当样本OD值除以阴性对照OD值大于等于2时判定为阳性例，并以样本OD值除以阳性对照OD值计算相对端粒酶活性值，其结果见表2。

表1 地鼠颊囊癌变过程中不同时期的

　　端粒酶活性OD值

组别	例 　　数	涂药侧		自身对照侧
		范围	±s	范围	±s
第7周	6	0.161 　　～0.441	0.318 　　±0.124	0.089 　　～0.097	0.093 　　±0.004
第10周	6	0.400 　　～0.876	0.603 　　±0.189	0.090 　　～0.106	0.098 　　±0.0035
第14周	6	0.679 　　～1.337	1.085 　　±0.245	0.085 　　～0.095	0.091 　　±0.0025
第20周	6	0.623 　　～1.118	0.869 　　±0.213	0.094 　　～0.103	0.097 　　±0.0043

表2 地鼠颊囊癌变过程中相对端粒酶活性值

组别	阳性例数		相对端粒酶活性值(±s)
	涂药侧	自身对照侧	涂药侧	自身对照侧
第7周	1	0	0.438±0.175	0.159±0.0037
第10周	3	1	0.919±0.142	0.165±0.0310
第14周	6	0	1.771±0.217	0.150±0.0023
第20周	6	1	1.398±0.194	0.163±0.0041

　　2.2 金黄地鼠颊囊癌变过程中端粒长度变化与端粒酶活性观察

　　金黄地鼠颊囊癌变过程中端粒长度变化、长度缩短速率与端粒酶活性结果见表3。把癌变过程中,涂药侧端粒长度与端粒酶活性做相关分析可得到两者呈负相关(r=-0.9654),涂药侧端粒长度缩短速率与端粒酶活性相关分析,可得到两者呈正相关(r=0.9471)。

表3 地鼠诱癌过程中各组涂药侧端粒长度、

　　长度缩短速率与端粒酶活性检测结果

　　3　讨 论

　　1994年Kim首创高灵敏度的端粒酶重复扩增法，使人们有可能更多地注意到了端粒酶与肿瘤发生的关系，也使Harley等^［6］1990年提出的“端粒假说”成为癌变机制的重要理论假说有了一系列可靠实验依据。假说认为端粒酶的活化是细胞走向永生化必需条件，即为恶性肿瘤形成的必需步骤，因此研究癌变过程中组织端粒酶的变化显得尤为重要。本实验研究了较为理想的一种口腔癌变动物模型的端粒酶活性变化，首次探讨了端粒酶与口腔癌变机理的关系。

　　本实验结果显示正常金黄地鼠颊囊粘膜组织内也呈现出一定水平的端粒酶活性，相当于HEK293细胞阳性对照的16％左右。Bacchetti等^［7］采用实验用大鼠的正常腺体、肝、肾等做端粒酶检测，也发现有一定端粒酶活性存在，并认为这与这些鼠组织细胞增生活跃有关。而颊囊粘膜细胞也具有高度分裂增殖和不断更新的能力，它们可表达一定水平的端粒酶，说明端粒酶对细胞增生、发育起重要调控作用。为了客观地分析端粒酶在DMBA诱发的金黄地鼠颊囊癌变过程中的变化，作者设定了涂药对侧为自身对照，消除正常粘膜细胞本身的端粒酶活性表达的影响，使结果可靠。

　　本实验研究应用端粒酶PCR-ELISA检测法，半定量地测定端粒酶活性。此方法比现有常用的Kim端粒重复扩增法具有一定优点，如灵敏度与同位素的TRAP法相当，但无使用同位素的危险，节省试剂和时间，减少污染机会，是一高灵敏度的非放射性光度酶免疫检测方法。用此方法检测的端粒酶在金黄地鼠颊囊癌变过程中的结果表明，随着颊囊粘膜组织细胞的分裂增殖和异常增生，端粒酶活性逐步升高，与自身对照比较有显著差异，涂药侧明显高于对照侧(P＜0.05）。当诱癌过程进入第14周非典型增生和原位癌期，其端粒酶活性水平为最高，达到HEK293细胞的177％，癌形成期次之，而第7周单纯增生期端粒酶活性呈弱阳性，只达到HEK293细胞的43.8％，这说明端粒酶在诱癌过程后期变化明显。酶活性水平较高，也表明此期间颊囊粘膜组织内端粒酶阳性表达细胞增多，而这一细胞亚群就具备了进一步分裂增殖向永生化发展（即恶性转化）的必需条件，正常细胞向癌细胞转变。Bednarek等^［8］在用TAP诱发鼠皮肤乳突状瘤的动态观察实验中，诱导初期（10周），11例中仅有1例表达端粒酶活性，而20周后，表达端粒酶活性的例数增多，到30周达到100%。他们这一结果与诱导组织细胞的组织病理学改变有关，在初期细胞处于整二倍体，分化较好时，细胞分裂增殖有序，当细胞成为非整倍体细胞异常增生时，则端粒酶活性水平逐渐增高，而端粒酶的活化可快速形成补充细胞染色体端粒DNA重复片段，维持端粒一定长度，促使细胞进入无限增殖。

　　本实验研究还将地鼠颊囊癌变中粘膜组织端粒长度的动态变化与端粒酶活性变化进行相关分析研究。结果表明：相互对应的诱癌时期内，端粒长度缩短与端粒酶活性呈负相关（r=-0.9654)，但其端粒长度缩短的速率却与端粒酶活性表达呈正相关（r=0.9471），这证明在金黄地鼠颊囊粘膜细胞中端粒长度改变的调控,主要受端粒酶活性影响，细胞依赖于端粒酶活化使端粒维持一定长度，从而具备无限增殖、逃避凋亡的能力，进而转化为恶性细胞。结果还表明．金黄地鼠颊囊癌变过程中，端粒长度变化最大期与端粒酶活性表达最高期是吻合的，都处于癌变过程的良性向恶性转变的时期，这进一步证实当端粒异常缩短,可引起染色体稳定性降低，位于其上的原癌基因和抑癌基因激活、突变、缺失，导致端粒酶激活和表达增多，使端粒DNA得到迅速补充，细胞染色体趋于稳定，分裂增殖继续，细胞无限增殖转化为癌细胞，癌肿形成。因此端粒酶活性升高，亦是地鼠颊囊粘膜癌变的一个早期分子指标。

　　综上所述，DMBA诱发的金黄地鼠颊囊癌变模型中，端粒酶活性随着诱癌时间延长，组织病理学改变向恶性转化而增高，与自身对照相比较有显著差异。端粒酶活性升高可作为癌变的早期诊断指标，同时也是端粒长度稳定的主要因素，因此本动物模型可作为针对抑制端粒酶、实现阻断和逆转癌变、达到治疗口腔恶性肿瘤目的的较理想模型，为深入研究、发展头颈肿瘤的基因诊断和治疗提供可靠的实验依据。■

　　基金项目：本课题为国家自然科学基金资助项目(编号 39670788)

　　 参考文献：

　　［1］Moyzis RK， Baolingham JM， Cram LS， et al． A highly conserved repetifive DNA squence（TTAGGG) present at the telomeres of human chromosomes． Proc Natl Sci USA,1988，85（16):6622～6626

　　［2］Morin GB． The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprein that synthesizes TTAGGG repeats. Cell，1989，59（4）：521～529

　　［3］Kim NW, Piatyszck MA, Prowse KR,et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994,266(5264):2011～2015

　　［4］Counter CM, Hirte HW, Bacchetti S, et al. Telomerase activity in human ovarian carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91(8):2900～2904

　　［5］高志，毛祖彝，徐平平,等．实验性口腔癌的端粒行为异常研究．华西口腔医学杂志，2000,18(1):48

　　［6］Harley CB, Patcher AB, Greider CW. Telomeres shorten during aging of human fibroblasts. Nature, 1990,345(31):458～460

　　［7］Bacchett S, Counter CM, Chadeneau KC, et al. Telomerase activity in human and murine somatic tissues and tumours. Proc Am Assoc Cancer Res, 1995,36(5):674～680

　　［8］Bednarek A, Budnuova I, Slage TJ, et al. Increased telomerase activity in mouse skin promalignent progression. Cancer Res, 1995,55(20):4566～4569

收稿日期：1998-12-01

修稿日期：1999-11-20