膀胱肿瘤多药耐药基因的表达及其临床意义

山西医药杂志 2000年第2期第29卷 论著

作者：刘尚莹　张泓　曹晓明　米振国　郝润喜

单位：刘尚莹（山西医科大学第一医院　030001）；张泓（山西医科大学第一医院　030001）；曹晓明（山西医科大学第一医院　030001）；米振国（山西医科大学第一医院　030001）；郝润喜（山西医科大学）

关键词：膀胱肿瘤；多药耐药基因；逆转录多聚合酶链反应

　　摘　要：：目的　探讨膀胱肿瘤多药耐药基因(MDR-1mRNA)的表达与临床化疗的相关性。方法　采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术，对26例正常膀胱粘膜和30例膀胱肿瘤MDR-1mRNA的表达进行了检测。结果　26例正常膀胱粘膜中MDR-1mRNA表达为15.4%，16例初发膀胱癌MDR-1mRNA有表达为37.5%，14例复发膀胱癌的MDR-1mRNA表达为78.6%，并对其进行了临床生物学行为的观察和比较。结论　多药耐药现象在正常膀胱粘膜中有表达，在部分初发膀胱癌中有先天性存在，RT-PCR方法检测膀胱肿瘤时具有相对敏感、特异、方便、快速和结果可靠等优点。

Expression of multidrug resistance gene (MDR-1mRNA) in bladder tumour and its clinical significance

　Liu Shangying　Zhang Hong　Cao Xiaoming　et al.

　　（First Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan,030001,China）

　　Abstract：Objective　To investigate the correlation between expression of multidrug resistance gene (MDR-1mRNA) in bladder tumor and its clinical chemotherapy.Method　Using RT-PCR technique,expression of multidrug resistance gene(MDR-1mRNA)in 26 specimen from normal bladder mucosa and 30 from bladder tumor were measured.Results　The results showed that the expression of　MDR-1mRNA　in 26 cases of normal bladder mucosa is 15.4%,that in 16 cases of untreated primary tumor is 37.5% and that in 14 cases of the recurrent tumor is 78.6%.Correlation of the MDR-1mRNA expression with the clinical biological behavior was also observed.Conclusion　The phenomenon of multi-drug resistance exists in normal bladder mucosa,but untreated primary tumor has a positive MDR-1mRNA expression,which correlates with the degree of malignance.The RT-PCR assay proved to be highly senitive,relatively quantitative and reliable for measuring the level of MDR-1mRNA expression in clinical specimens.

　　Key words：Bladder neoplasms；　Multi-drug resistance-1mRNA；　Reverse transcription polymerase chain reaction

　　膀胱肿瘤具有易复发的生物学特征，术后用药物膀胱腔内灌注治疗能明显改善预后。但化疗仍存在许多问题，其中多药耐药(MDR)是化疗失败的重要因素之一，因此MDR成为近年来肿瘤临床和基础研究中的热点。多种因素可引起MDR，其中人们研究最多、最广的是P-糖蛋白机制，蛋白的表达受多种因素的影响，本实验在基因的水平上观察多药耐药基因(MDR-1mRNA)的表达及对临床生物学行为的影响。

　　1　资料与方法

　　1.1　研究对象

　　全部标本均取自本科1998年1月至1998年12月间住院患者手术切除的膀胱肿瘤组织，术前经膀胱镜检查发现，并经病理学检查证实。病理类型：本组30例均为膀胱移行细胞癌，按WHO病理组织分级：G₁10例，G₂13例，G₃7例。初发的肿瘤16例，经化疗药物膀胱内灌注后复发的肿瘤14例。

　　正常对照为术中在膀胱肿瘤基底部2 cm以外的正常膀胱粘膜，均为术中切除并经组织学检查为正常者。

　　1.2　组织标本的采集及贮存

　　全部标本均在手术时切取膀胱肿瘤时收取，取材时避免取到肿瘤中心的坏死组织，实验选用手术后2 h内的鲜活标本或标本取材后立即放入－70 ℃超低温冰箱中保存待检。

　　1.3　主要试剂

　　AMV逆转录酶购自Promega公司，TaqDNA聚合酶购自中国科学院遗传所。

　　1.4　主要仪器

　　Gene Cycler PCR仪(B10-RAD，USA)。

　　1.5　多药耐药基因(MDR1)表达水平的检测

　　采用定量RT-PCR方法进行。

　　1.5.1　组织总RNA的提取：样品中总RNA提取采用异硫氰酸一步法进行，提取的总RNA加入50～100 μL DEPC去离子水溶解后，取部分样品经甲醛凝胶电泳检测鉴定其质量，并用紫外分光光度计测定A₂₆₀及A₂₈₀，计算A₂₆₀/A₂₈₀，比值均大于1.8，根据A₂₆₀计算其RNA含量。

　　1.5.2　通过逆转录反应(reverse transcription)合成cDNA。逆转录反应在一个50 μL的反应体系中进行，反应体系中包含总RNA 5 μL，随机引物(Random Primer)0.5 μg RNA酶抑制剂(Rnasin 40 U，AMV 10 U，dNTP 40 μL)。在42 ℃水浴1 h，完成RT，在95 ℃水浴中5 min，将酶灭活后立即置冰浴中，加DEPC 50 μL，制备出用于PCR的cDNA的模板。

　　1.5.3　PCR扩增反应：PCR扩增反应采用两对寡核苷酸引物，其一为MDR-1mRNAcDNA引物，引物序列：MDR-1mRNA正义：5′-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3′；反义：5′-GTTCAAACTTCTGCTCCTCA-3′。内对照引物β₂微球蛋白参照文献设计，5′-ACCCCCACTGAAAAAGATGA3′-ATCTTCAAACCTCCATGATG。

　　1.5.4　PCR结果判断：PCR产物经电泳分离后，阳性样品应有三条带，分子量大小分别为300 bp和170 bp，其中300 bp为内标b2-MG，而170 bp产物则为MDR-1mRNA基因。两条带强度之比(MDR-1mRNA/b2MG)为MDR-1mRNA基因表达相对值，据此相对值，即可以判断各样品中MDR-1mRNA表达程度的差异。

　　2　结　果

　　应用上述RT-PCR条件，对30例膀胱肿瘤的标本和26例正常膀胱粘膜组织进行了检测。26例正常膀胱粘膜标本中MDR-1mRNA的表达为15.4%。30例膀胱肿瘤中MDR-1mRNA的阳性率为17/30(56.7%)，其中G₁、G₂、G₃肿瘤阳性率分别为40%、61.5%、71.4%。16例初发肿瘤标本阳性率为37.5%，14例化疗后复发肿瘤标本阳性率为78.6%。结果提示正常膀胱粘膜组织有MDR-1mRNA的表达，MDR-1mRNA的表达与肿瘤的分化程度有关。化疗后复发肿瘤MDR-1mRNA表达有明显增强。

　　3　讨　论

　　膀胱肿瘤细胞对化疗药物的耐药性是膀胱肿瘤术后化疗的主要障碍。临床上许多肿瘤在经历了最初有效的化疗之后，最终仍难免于复发，其主要原因是肿瘤细胞对化疗药物的耐药性^［1，2］。与MDR1基因相关的常用化疗药物包括烷化剂类(如BCNU，ME-CCNU等)，植物碱类(如长春新碱、长春花碱、VM26等)，抗生素类(如丝裂霉素、阿霉素、博来霉素等)，激素类(如地塞米松等)。这些药物通常为分子量较大的亲脂性化合物，是膀胱肿瘤治疗中常用的药物^［3］。当肿瘤细胞对上述其中一种药物发生耐药时，即可同时对其他各类药物发生交叉耐受，因此，膀胱肿瘤中MDR1基因的表达对化疗药物的耐药性密切相关。

　　有关MDR细胞表型归纳起来主要表现有^［1］：①增强对多种细胞毒药物的耐受；②降低细胞内药物的浓度；③过度表达170 000～180 000膜糖蛋白(P-GP)；④增加药物的细胞外排能力；⑤协同细胞膜活性因子感受性；⑥耐药能力能被某些化学物质逆转。

　　殷丽明等^［3］认为，MDR1基因是存在于人基因组中的正常片段，但其是否表达，或表达的高低，则随组织细胞、环境诱导因素不同而有所不同。对其表达的反映与检测常在蛋白与mRNA两个水平。前者以免疫组织化学染色为主，该法因受条件、试剂及主、客观因素影响，难以定量检测，且方法较为繁琐；另一检测水平则是对mRNA的检测。众所周知，所有生物体都是以核酸的形式通过碱基顺序贮存各自特异性的遗传信息，因而直接对MDR-1从基因水平检测具有高效、灵敏、特异的优点^［3，4］。然而，mRNA检测的传统方法(如原位杂交、Northern印迹、点杂交、以及S核酸酶试验、Rnase保护性试验等)操作复杂，敏感性较差，因而受到了极大的限制。我们采用RT-PCR法，在逆转录酶作用下，利用已转录的MDR-1之mRNA为模板，合成MDR-1的cDNA后，以PCR体外扩增法为检测手段，与检测基因表达的其他方法相比较，具有省时、省事、高效、特异的优点，在临床上有广阔的应用前景。

　　按照肿瘤细胞学分级，本组中G₁、G₂、G₃肿瘤阳性率分别为40%、61.5%、71.4%，提示MDR-1mRNA的表达与膀胱癌的恶性程度和组织学分级有相关性。

　　体外研究证实^［5］，人膀胱癌细胞系经阿霉素等化疗药物诱导后可以产生对多种无关抗细胞毒性药物的交叉耐药性，本组16例初发肿瘤标本阳性率为37.5%，14例化疗后复发肿瘤标本阳性率为78.6%。化疗后复发肿瘤MDR-1mRNA表达有明显增强。这提示膀胱癌术后复发与化疗药物诱导的多药耐药有关，是膀胱内灌注化疗失败的重要原因，但这并不是唯一的原因。

　　李晓飞等^［6］应用免疫组织化学技术检测41例膀胱癌的P-GP表达情况，总体阳性率63.4%。25例初发肿瘤的P-GP表达阳性率48%(12/25)，而化疗后复发肿瘤P-GP表达阳性率高达87.8%(14/16)。复发肿瘤P-GP表达阳性率显著高于初发肿瘤。这提示可能由于接触抗癌药物后MDR-1基因扩增及P-GP过度表达，致使化疗失败，肿瘤复发^［7，8］。

　　临床价值：MDR-1高表达可导致肿瘤对多种药物发生耐受，但不是对所有药物都耐受^［9］。MDR-1基因表达主要可造成肿瘤对几种亲脂性药物产生程度不同的耐受，其中对生物碱类高度耐受，对蒽环类中度耐受，对Vp-16等低度耐受，对烷化剂或抗代谢类药物不耐受。故在MDR-1阳性表达的患者化疗方案中，临床医师应注重DDP、5-Fu和氮芥。对阴性和低表达患者可选用生物碱类、蒽环类和Vp-16类；而对阳性患者可同时增用MDR-1逆转剂、增敏剂等，以增加临床化疗效果^［10］。

　　作者简介：刘尚莹，男，1959年4月生，副教授，山西医科大学第一医院，030001

　　参考文献：

　　1，李俐.Pgp与肿瘤的多药耐药性.中国肿瘤临床与康复,1998，5(1)：76-77

　　2，郭和清,鲁功成,熊旭林，等.人膀胱癌P-糖蛋白表达的临床意义.中国肿瘤临床，1998，25(9)：649-652

　　3，殷丽明，陈克能，李殿发，等.常见恶性肿瘤新鲜组织中原发性多药耐药基因表达的初步研究.中华肿瘤杂志，1997，19(6)：420-422

　　4，周兴，刘春晓，郑少波，等.膀胱癌MDR-1 mRNA表达水平及临床意义.中华泌尿外科杂志，1999，19(2)：86-87

　　5，Pu YS,Tsai TC,Cheng AL,et al.Expression of MDR-1 gene in transitional cell carcinoma and its correlation with chemotherapy response.J Urol,1996,156:271-275

　　6，李晓飞，王晓波，陈立中.膀胱癌多药耐药基因产物的表达及临床意义.中华实验外科杂志，1999，16(1)：12-13

　　7，陈忠，章咏裳，李家贵，等.人膀胱癌细胞耐药株多基因蛋白表达的意义.中华泌尿外科杂志，1999，19(12)：707-709

　　8，韩瑞发，吴长利，张广建，等.膀胱癌多向耐药基因P-gp170表达的研究.中华泌尿外科杂志，1994，15：419-421

　　9，陈忠，章咏裳，李家贵，等.多药耐药相关蛋白和P-糖蛋白在膀胱癌表达的意义.中华泌尿外科杂志，1998，19(7)：394-396

　　10，王丰，孙春雷，赵建伟.107例肿瘤组织多药耐药基因的检测.临床检验杂志，1999，3：166-167

收稿日期：1999-11-26