自体细胞因子诱导的杀伤细胞治疗白血病合并丙型病毒性肝炎的首次报告
北京医科大学学报 2000年第3期第32卷 科研快报
作者：童春容 耿彦彪 江倩 陆道培
单位：童春容 陆道培（北京大学人民医院细胞治疗中心, 北京100044）；耿彦彪 江倩（北京大学血液病研究所）
关键词：急性白血病；治疗；细胞因子诱导的杀伤细胞；丙型肝炎；治疗
［摘 要］ 目的:评价细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer, CIK)治疗白血病合并丙型病毒性肝炎患者的有效性及安全性。方法:采用血细胞分离机大量采集患者的外周血单个核细胞，再用抗CD3单抗、白细胞介素2、干扰素γ培养10 d左右，然后将细胞洗涤后经静脉回输给患者。结果:12例患者在CIK治疗后其血清HCV-RNA均有一段时间转阴，其中7例持续转阴至报告时（观察时间为7～56个月），2例持续转阴6个月后因难治性白血病死亡。CIK治疗后，6例患者肝功能（ALT和/或BIL）均有明显改善；另6例肝功能持续正常。CIK输注后除一过性发热，畏寒、疲乏外，无其它严重副作用。结论:自体CIK 细胞治疗具有明显抑制甚至清除白血病患者合并丙型肝炎病毒感染的作用，可明显改善患者的肝功能，静脉输注安全。
［中图分类号］ R733.71 ［文献标识码］ A
［文章编号］ 1000-1530（2000）03-0251-05
First report of the effect of auto-cytokine induced killers
on HCV infection in the patients with leukemia
TONG Chun-Rong，LU Dao-Pei
（Cellular Therapy Center, Peoples' Hospital, Peking University, Beijing 100044, China）
GENG Yan-Biao，JIANG Qian
（Institute of Hematology, Peking University）
ABSTRACT Objective: To evaluate the safety and therapeutic effects of auto-cytokine induced killers(CIKs) on hepatitis C virus infection in the patients with leukemia. Methods: The patients' peripheral blood mononuclear cells were collected with blood cell separator, then cultured in the medium containing monoclonal antibody against CD3， interleukine-2 and interferon-γ for about 10 days in vitro， finally washed twice and transfused back to the patients themselves. Results: HCV-RNA in the sera from all 12 patients converted negative for a period after CIK transfusion, of whom, 7 continued negative till now (7～56 months), 2 continued negative for 6 months and then died from refractory leukemia. After CIK transfusion, 6 cases' liver function (ALT and/or BIL) got much better, and the other 6 cases' continued normal. Except temporal fever, chill, fatigue etc, no severe side effects happened during or after auto-CIKs transfusion. Conclusion: Auto-CIK transfusion intravenously can inhibit or even clear HCV in the patients with leukemia, and obviously improve the patients' liver function. It is safe.
KEY WORDS Acute leukemia/ther; Cytokine induced killer; Hepatitis C/ther▲
细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer, CIK）是外周血淋巴细胞经抗CD3单抗（monoclonal antibody against CD3, MabCD3）、 白细胞介素-2(interleukine-2, IL-2)和干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)体外刺激、培养、扩增出来的杀伤细胞［1，2］。我单位临床前的研究显示白血病患者自体CIK细胞具有杀伤自体及异体白血病细胞，清除白血病标志细胞的作用。在治疗白血病的初步临床试验中，我们首次发现自体CIK可明显抑制甚至清除白血病患者血清的丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV），患者的肝功能不但没有加重，反而明显改善。现将自体CIK治疗白血病合并HCV感染患者的效果报告如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象
1995年8月至2000年4月期间，本单位共收治12例各类急性白血病患者，年龄14～63岁，均接受了反复化疗或(和)造血干细胞移植治疗。患者均在初始化疗中多次输注血液（或血液制品），一段时间后其血清HCV-RNA为阳性。在CIK治疗前1个月内，HCV-RNA仍然阳性。11例患者在输血（或血液制品）一段时间后出现肝功能异常，常在化疗后恶化，经多种保肝药物治疗。在接受第1疗程CIK治疗前，6例患者的肝功能正常或接近正常，另6例患者的肝功能有不同程度的异常。病原检测由北京大学肝病研究所完成，HCV-RNA采用逆转录-套式-聚合酶链反应方法（RT-nested-PCR）检测，抗-HCV采用雅培公司的ELISA试剂盒检测。
1.2 自体CIK细胞的培养
每疗程用血液细胞分离机（COBE公司的Spectrum2991型或Baxter 公司的CS3000plus型）采集患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMNC）0.5×109～6×109。细胞培养在超洁净实验室（good laboratory practice, GLP）进行，所有可能开放的操作均在百级超净台内进行。用RPMI 1640培养液（Gibco）洗涤细胞2次, 将细胞悬浮于透气性培养袋(Baxter)中，前8例患者的细胞悬浮于RPMI 1640完全培养液中,含10%(体积分数)人AB型血清(北京市血液中心)、Hepes 25 mmol·L－1、左旋谷氨酰胺2 mmol·L－1；后4例的细胞悬浮于治疗级AIM-V无血清培养液（Gibco）中。调整细胞浓度为每毫升1×106，并加入 IFN-γ( 上海克隆生物高技术公司) 2 000 IU·ml－1，IL-2 ( 瑞得合通药业股份有限公司) 1 000 IU·ml－1及MabCD3（古巴分子免疫中心）50 μg·L－1。将细胞置于37℃，5%(体积分数)CO2条件下培养。以后每3～4 d用培养液调整细胞浓度至每毫升1×106，并加入IL-2 1 000 IU·ml－1。
1.3 CIK细胞的输注及IL-2治疗
CIK培养至10 d左右时，如细菌霉菌培养阴性、活细胞＞95%，分2 d收集细胞回输给患者。先将细胞悬液离心去上清后，再用2 g·L－1白蛋白(上海莱氏血液制品公司) 及IL-2 100 IU·ml－1的生理盐水洗涤2次，最后将细胞悬浮于400 ml白蛋白(20 g·L－1)及IL-2 (1×106 IU)的生理盐水中，通过输血器经静脉回输给患者。后9例患者在回输CIK后次日接受IL-2 5×105 ～1×106 IU·d－1，皮下注射，共5 ～10 d。
1.4 细胞免疫表型及细胞内因子的检测
细胞免疫表型的染色：采用荧光标记的单抗（COULTER International Immunotech）进行染色，每一反应管加入5×105细胞或全血100 μl，再按试剂生产厂家的要求加入单抗，阴性对照管不加抗体，4℃避光作用30 min。如为全血，加入红细胞裂解液作用后离心去上清。用PBS洗涤2次后再加10 g·L－1多聚甲醛固定，4℃避光保存，1周内上机检测。
细胞内因子的染色：每一反应管加入1×106细胞，再按试剂生产厂家的要求加入FITC标记的抗CD4或CD8单抗，阴性对照管不加抗体，4℃避光作用30 min。用PBS洗涤1次后，加入固定及穿孔液、PE标记的抗IFN-γ或IL-10单抗（Pharmingen），阴性对照管加入与抗IFN-γ或IL-10单抗同型的PE标记鼠抗体，4℃避光作用30 min。用PBS洗涤2次后再加10 g·L－1多聚甲醛固定，4℃避光保存，1周内上机检测。
上机检测：用Beckon Dickinson公司的FCSsort型流式细胞仪，488 nm激发光谱检测细胞，用Cell Quest软件分析数据。利用前向角光散射及侧向角光散射选择单个核细胞群进行分析，再用阴性对照管设定荧光阳性界限。反应管细胞的阳性值减去阴性对照管的阳性值即得反应管细胞的测定值。
1.5 HCV-RNA的检测
由北京大学肝病研究所完成，采用RT-nested-PCR方法，其引物由该所按Okamoto［3］报道的序列合成。
1.6 临床监测指标
所有临床观察及监测均在人民医院的门诊或病房进行，血液生化指标、尿常规检测由人民医院检验科完成。
毒性反应监测： 在回输CIK过程中及回输后每天观察出现的毒性反应，直至毒性反应消失或接受其它治疗。观察项目及分级参照世界卫生组织规定的急性及亚急性毒性反应标准。
疗效监测：回输CIK前、后观察患者异常症状体征(如食欲下降、厌油、黄疸、肝大)，血白细胞分类、免疫学标志、肝功能等指标，直至患者接受其它治疗。CIK回输后每个月检测HCV-RNA 1次；如连续2次获得相同的结果且已停化疗，每3～6个月再检测1次； 持续阴性1年以上且不再化疗者，每6～12个月再检测1次。
2 结果
2.1 CIK的培养及免疫标志分析
每次采集的细胞培养后回输为1疗程。12例共接受22疗程CIK治疗，其中1例接受4疗程治疗，3例接受3疗程治疗，1例接受2疗程治疗，7例仅接受1疗程治疗。每疗程回输的CIK总数为5×109～22.8×109（表1）。
5例患者细胞培养前、后的免疫标志变化见表2。CIK中的主要细胞为CD3+及CD8+细胞, 大多数患者分别达到90%、65%以上；在不同患者的CIK细胞中CD3+、CD8+细胞也是变化较为一致的细胞群。CD3+/CD56+细胞是增加幅度最大的细胞群，其绝对值平均增加15倍，但是不同患者的增加幅度相差较大。CD4+、CD3－/CD56+细胞的比例及绝对值仅轻度增加，甚至下降。培养后CIK细胞分泌IFN-γ的比例明显高于IL-10(表3)。
表1 回输的CIK细胞数及其对患者血清HCV-RNA的影响
Table 1 The transfused CIKs' number and HCV-RNA in the patients' sera
| Case
no. |
CIK
course |
Transfused
CIKs |
HCV-RNA in serum |
| 1 |
1 |
14.3×109 |
Continue negative till now after first course（56 months） |
| |
2 |
16.0×109 |
| |
3 |
18.0×109 |
| 2 |
1 |
5.3×109 |
Continue negative till now after third course（36 months） |
| |
2 |
23.0×109 |
| |
3 |
14.3×109 |
| |
4 |
15.0×109 |
| 3 |
1 |
10.3×109 |
Sometimes positive sometimes neg (31 months) |
| |
2 |
18.1×109 |
| 4 |
1 |
8.9×109 |
Continue negative till now after the third course（11 months） |
| |
2 |
22.3×109 |
| |
3 |
17.0×109 |
| 5 |
1 |
22.5×109 |
Still positive (31 months) |
| |
2 |
17.4×109 |
| |
3 |
16.3×109 |
| 6 |
1 |
19.8×109 |
Continue negative till now after first course（29 months） |
| 7 |
1 |
19.1×109 |
Continue negative for 6 ms, then died from refractory leukemia |
| 8 |
1 |
22.8×109 |
Continue negative till now after first course（20 months） |
| 9 |
1 |
17.6×109 |
Continue negative till now after first course（20 months） |
| 10 |
1 |
16.8×109 |
Continue negative for 7 ms, then died from refractory leukemia |
| 11 |
1 |
20.0×109 |
Still positive(12 months） |
| 12 |
1 |
7.8×109 |
Continue negative till now after second course（7 months） |
| |
2 |
12×1010 |
ms, months; neg, negative; pos, positive.2.2 CIK回输后患者血清 HCV-RNA及肝功能的变化
CIK回输后血清HCV-RNA的追踪结果见表1。12例患者的血清HCV-RNA均在CIK治疗后转阴一段时间，其中9例持续转阴。在持续转阴的9例中，除2例持续转阴6个月以后死于难治性白血病外，其他7例均持续转至报告时(7～56个月)，其中持续转阴1年以上者5例。大多数患者的HCV-RNA在CIK回输后2～3个月时转阴，1例在回输后4 d即转阴。在持续阴转的患者中，6例仅1疗程即持续转阴，1例2疗程后持续转阴，2例经3疗程CIK治疗才持续阴转。目前有3例患者的血清HCV-RNA仍阳性，其中1例已治疗3个疗程，另2例仅治疗1个疗程。
CIK治疗前肝功能正常的患者在治疗后仍正常（观察至下一次化疗）。6例第1疗程CIK治疗前肝功能异常的患者，在CIK治疗后均有不同程度的改善，此后1年多的追踪观察显示，除1例死于难治性白血病外，另5例的肝功均正常或接近正常。CIK治疗后肝功能的变化有两种形式：(1) 肝功能指标逐渐下降，3例回输细胞后10 d左右谷丙转氨酶（ALT）或/和总黄疸指数(TBIL)下降至正常或接近正常；(2) 肝功能指标比治疗前升高，一段时间后再下降：2例在CIK回输后ALT升高，2周左右达高峰，再逐渐降低至正常或接近正常； 1例患者在CIK回输后1 d TBIL即升高，10 d 降至正常范围。CIK治疗后患者的肝功能对化疗的耐受性明显提高： 5例需要反复化疗的患者在CIK治疗后1～2年内反复化疗，均未引起肝功能的明显恶化。
表2 培养10 d 时CIK细胞的免疫表型(n=5)
Table 2 The immunophenotype of CIKs after culturation to 10 d (n=5)
| Cultured
days |
Mean (Range) |
| |
CD3+ |
CD4+ |
CD8+ |
CD3－/CD56+ |
CD3+/CD56+ |
| |
% |
70 |
42 |
31 |
7 |
2 |
| |
|
(62－78) |
(31－49) |
(23－46) |
(4－13) |
(0－6) |
| d0 |
Total number(1×108) |
29 |
17 |
13 |
3 |
1 |
| |
|
(3－40) |
(2－24) |
(1－23) |
(0.2－6.5) |
(0.02－3) |
| |
| |
% |
94 |
36 |
70 |
2 |
10 |
| |
|
(88－96) |
(30－41) |
(61－77) |
(0.5－6) |
(1－33) |
| d10 |
Total number(1×108) |
167 |
67 |
124 |
4 |
18 |
| |
|
(72－202) |
(28－99) |
(47－161) |
(0.4－10.5) |
(0.8－58) |
2.3 CIK回输后患者外周血免疫标志细胞的变化
我们对5例患者的外周血细胞计数和CD3+、CD4+、CD8+、CD3+/CD56+、CD3－/CD56+细胞计数进行了观察。回输后外周血淋巴细胞绝对值及比例均有不同程度的升高，绝对值最高增加 11倍，6～10 d达高峰，以后逐渐下降， 20～120 d下降至回输前水平。4例(4/5)回输CIK后其外周血CD3+、CD4+、CD8+、CD3+/CD56+、CD3－/CD56+细胞绝对值及占PBMNC的比例有不同程度的升高，尤以CD3+、CD8+细胞升高明显，升高幅度最大的患者（例12）其CD3+细胞从36.4%升至84.7%，CD8+细胞从14.1%升至67.9%，回输后1个半月才回到上一次化疗前水平，但仍高于CIK回输前水平。
2.4 急性及亚急性毒性反应
回输CIK后出现的主要副作用是畏寒、寒战、发热、食欲下降、疲乏无力。除最初2个疗程（回输细胞量少）外，回输细胞后患者均出现畏寒、发热（37.5～40℃），多数患者于细胞输注完1～3 h发生， 持续4～8 h 后自然消退，最长1例持续30 h。部分患者出现恶心、呕吐、头疼或全身疼痛， 1例出现腹泻。1例在输注过程中出现室性早搏，减慢输注速度后室性早搏消失。注射IL-2期间多数患者出现疲乏, 约半数患者出现头痛、全身痛、发热；2例注射后局部红肿，改为静脉滴注后好转。如果患者在2周内未化疗,CIK及IL-2治疗不引起外周血红细胞、血红蛋白及血小板计数的明显变化，或仅引起血小板计数的轻度降低。CIK及IL-2治疗不引起血糖、心肌酶、肾功能、尿酸、血电解质等血液生化指标和尿常规的变化。治疗中无1例发生严重毒副反应。
3 讨论
急性白血病患者在反复化疗或造血干细胞移植治疗过程中常常输注血液制品，而且患者免疫低下，HCV感染的发病率较高，且往往迁延不愈。逯爱平等［4］报告血液病患者中HCV感染的发生率高达30%以上，我们总结近5年本院急性白血病住院患者HCV感染的发生率也有10%。急性白血病患者一旦感染HCV，即使采用干扰素治疗也很难消除，干扰素尚有降低血细胞的作用，限制了其应用；虽然阿糖胞苷化疗可使部分患者的HCV-RNA转阴，但很快又转阳性，不能持久。由于感染HCV的白血病患者的肝功能常在化疗后恶化，临床医师往往对选择大剂量化疗有顾虑而采用小剂量方案，故白血病的长期存活率较低。本组12例中11例患者在既往化疗后肝功能常恶化，2例患者的胆红素明显升高。经CIK治疗后12例的血清HCV-RNA均有一段时间转阴，9例持续转阴；另3例HCV-RNA转阳的患者中，2例仅治疗1疗程，如果继续治疗，还有较大转阴的可能。6例治疗前肝功能异常的患者在CIK治疗后肝功能均明显好转，患者肝功能对反复化疗的耐受性也明显提高。这些结果显示自体CIK具有很好的抗丙型肝炎病毒的作用。由于CIK细胞尚可清除残留白血病标志细胞，不需要每天应用，对血像无明显影响，甚至可升高血白细胞，故在治疗白血病合并丙型病毒性肝炎方面有很好的应用前景。
表3 CIK培养前后产生IFN-γ∶IL-10的
淋巴细胞比例变化(Case 12)
Table 3 The ratio of the lymphocytes producing IFN-γ to
IL-10 after cultivation of CIK (Case 12)
| |
d0 |
d7 |
| IFN-γ |
0.39% |
30.49% |
| IL-10 |
0．29% |
0％ |
The percentage of IFN-γ or IL-10 producing cells at D0 is among the PBMNC. 病毒逃避宿主免疫监视的机制可能有以下几个方面： 病毒干扰宿主MHC-抗原复合体的表达，从而抑制病毒抗原特异性T细胞（cytotoxic T lymphocyte， CTL）的激活; 病毒抗原突变，逃逸T细胞特异性的识别与清除；病毒产生的细胞样因子或受体负调控免疫应答等。自体CIK细胞可能通过以下机制发挥抗病毒作用:(1)体外培养CIK过程中采用的MabCD3及IL-2等细胞因子直接激活扩增CTL，回输后直接杀伤病毒感染的细胞。一些研究显示,MabCD3+IL-2培养肿瘤引流的淋巴结细胞及肿瘤浸润性淋巴细胞可维持其抗肿瘤特异性，这提示MabCD3+IL-2等细胞因子可扩增体内已存在的CTL。我们在临床治疗试验中观察到部分患者在CIK回输后1 d 开始有一段时间肝功能恶化，较短时间内HCV-RNA即转阴性，可能提示这一机制。（2）研究显示MabCD3+IL-2培养激活的T细胞可分泌多种细胞因子如IFN-γ、IL-2等。我们的试验也显示,CIK细胞中分泌Ⅰ类细胞因子如IFN-γ的细胞比例明显高于分泌Ⅱ类细胞因子如IL-10的细胞比例，这些细胞因子可直接渗透细胞内抑制或杀伤病毒,或通过改善体内的细胞因子环境，上调病毒感染细胞的MHC分子及共刺激分子，激活、扩增病毒特异性CTL、巨噬细胞、自然杀伤细胞等，从而清除病毒。我们在临床治疗试验中观察到以下一些现象符合这一机制：回输CIK细胞后患者的淋巴细胞、CD3+、CD8+细胞可升高数周甚至长达数月；2 例患者回输CIK后外周血淋巴细胞绝对值有两个高峰，一是在回输细胞后6～10 d，另一是在回输后1个月左右；多数患者在CIK回输后2～4个月HCV-RNA才转阴；治疗后部分患者的肝功逐渐好转，并无恶化的阶段。
由于观察的例数还较少，尚不能总结出影响CIK抗丙型肝炎病毒疗效的因素。鉴于自体CIK临床应用具有明显的抗丙型肝炎病毒的作用，其作用机制及影响疗效的因素值得进一步探讨。■
基金项目：卫生部科学研究基金(96-1-268）资助课题。
参考文献
［1］Schimidt-Wolf IGH, Negrin RS, Kiem HP, et al. Use of a SCID mouse/human lymphoma model evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity［J］. J Exp Med, 1991,174:139-149
［2］Lu PH, Negrin RS. A novel population of expanded human CD3+CD56+ cells derived from T cells with potent in vivo antitumor activity in mice with severe combined immunodeficiency［J］. J Immunol, 1994, 153:1687-1696
［3］Okamoto H. Detection of hepatitis C virus RNA by a two-stage polymerase chain reaction with two pairs of primers deduced from the 5′-noncoding region［J］. Japan J Exp Med, 1990, 60:215
［4］逯爱平，盛瑞媛，王爱霞.血液病患者的丙型肝炎病毒感染［J］.中华传染病学杂志，1997,15:89-91
收稿日期：2000-04-20
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