肝癌、肝硬变患者外周血淋巴细胞rDNA转录活性的测定及其临床意义
福建医科大学学报1999年第33卷第2期
林明晞杨映红 王平
目的:研究原发性肝癌、肝硬变患者外周血中淋巴细胞rDNA转录活性的变化，探讨其诊断原发性肝癌的应用价值。方法:应用真彩色计算机图像分析法，测定20例健康献血员、30例肝硬变患者及28例原发性肝癌患者外周血淋巴细胞rDNA转录活性的变化。结果:原发性肝癌患者的银染核仁积分面积／细胞核积分面积的比值和银染核仁积分光密度／细胞核积分光密度的比值，以及细胞核内银染颗粒数值均比正常对照和肝硬变患者降低(P＜0.01)。 结论:外周血淋巴细胞rDNA转录活性可作为肝癌诊断的参数。
关键词：原发性肝癌 外周血淋巴细胞 rDNA转录活性
近年来细胞核仁形成区的银染程度被认为能够准确反映细胞中脱氧核糖核酸蛋白体（rDNA）的转录活性水平，其与细胞增殖活性密切相关，对良恶性变的鉴别诊断也有很大价值［1］，故被广泛应用于肿瘤分级、分型的检测。笔者自1996～1998年应用计算机图像分析技术对原发性肝癌、肝硬变患者及正常人的外周血淋巴细胞中的rDNA转录活性进行检测，旨在探讨各组间的差异以及对原发性肝癌的临床应用价值。
1 材料与方法
1.1 标本来源 健康献血员，男性13例，女性7例，年龄32.8±6.2岁。肝硬变患者30例，男性17例，女性13例，年龄41.2±5.3岁。原发性肝癌患者28例，均经影像学和生化检查证实，男性19例，女性9例，年龄47.0±4.7岁，其中16例发现有门脉瘤栓或有淋巴结转移。
1.2 培养和制片 用肝素化注射器抽取静脉血1ml，采用微量全血培养72h。离心细胞悬液，弃上清，沉淀物加0.075mol/L氯化钾5ml，混匀后置37℃水浴箱20min。取出后用甲酸-硝酸银溶液（1%甲酸，2%明胶，15%硝酸银）洗细胞3次。将细胞沉淀滴在玻片上并摔散，放在37℃温箱中晾干，即可染色。
1.3 染色 将玻片置于80℃恒箱中，每张玻片上滴3滴染色液（同1.2），加上盖玻片，约15min取出，蒸馏水冲洗、晾干。在显微镜下可见淋巴细胞核内褐色银染颗粒。
1.4 图像分析系统检测 观察指标：银染核仁积分面积/细胞核积分面积比值(IS)和银染核仁积分光密度/细胞核积分光密度比值(IOD)，以及细胞核内银染颗粒计数(AgNORs)，测量每张片50个细胞核银染强度的相对值。
1.5 统计学处理 各观察指标数值用均数±标准差表示，组间显著性检验用t检验。
2 结 果
2.1 正常人、肝硬变和原发性肝癌患者外周血淋巴细胞银染情况见图1～3。
图1 正常人周围淋巴细胞，示细胞核中银染rDNA含量 ×200
图2 肝硬变患者周围淋巴细胞，核中银染rDNA含量高于正常。×200
图3 肝癌患者周围淋巴细胞，核中银染rDNA含量明显增加。×200
2.2 淋巴细胞核银染强度比较 图像分析结果见表1。
表1 正常人、肝硬变和肝癌患者外周血淋巴细胞核银染强度的比较(%)
| 组别 |
n |
IS |
IOD |
AgNORs |
| 正常人 |
20 |
9.18±0.77 |
8.97±0.86 |
9.06±0.53 |
| 肝硬变 |
30 |
9.26±0.69 |
9.34±0.57 |
8.99±0.63 |
| 肝癌 |
28 |
4.22±0.57* |
5.84±0.33* |
3.66±0.43 |
IS:核仁积分面积/细胞核积分面积;IOD:核仁积分光密度/细胞核积分光密度;AgNORS:细胞核内银染颗粒计数.与正常组比较,*：P＜0.01.
2.3 不同时期肝癌患者外周血淋巴细胞核银染强度比较见表2。
表2 肝癌患者淋巴细胞核银染强度的比较(%)
| 组别 |
n |
IS |
IOD |
AgNORs |
| 无转移 |
12 |
4.30±0.31 |
4.86±0.63 |
3.57±0.23 |
| 已转移 |
16 |
4.16±0.34 |
5.01±0.14 |
3.61±0.26 |
3 讨 论
既往研究资料表明，细胞DNA转录活性分析对肿瘤的诊断、肿瘤的分级以及预后的判断、治疗方案的选择具有重要意义［2］。核仁组成区的嗜银蛋白（AgNORs)是一种酸性非组蛋白，在rDNA转录活性中起重要调控作用，并可用一步银染方法显示出来。本文表明，应用核仁组成区嗜银蛋白银染技术结合图像分析系统对肝癌患者外周血淋巴细胞进行测定能够提供较客观的辅助诊断依据。
本研究中，原发性肝癌患者周围淋巴细胞的IS、IOD及AgNORs，计数值均比正常人和肝硬变患者低下（P＜0.01），说明患者抗肿瘤免疫力显著下降，其原因可能与原发性肝癌细胞释放甲胎蛋白等免疫抑制因子有关。此外，本研究结果还表明，不论肝癌组织有否转移，其周围淋巴细胞核的银染强度无明显差异（P＞0.05），表现为IS、IOD及AgNORSs计数值相差甚微。由此也说明一旦肿瘤形成，便形成免疫抑制物释放，导致机体抗肿瘤免疫下降，有可能表现出rDNA转录活性的变化。陈立奇等［3］也曾报告骨肉瘤小鼠动物模型中，早期即表现出rDNA转录活性增高。为此，笔者认为外周血淋巴细胞rDNA转录活性测定有助于原发性肝癌的鉴别诊断。作者单位：福建医科大学附属协和医院病理科(福州 350001)
参考文献
1 林其燧,陈立奇,吴 卫，等.外周淋巴细胞脱氧核糖核酸核蛋白体转录活性分析.中华医学检验杂志,1996;19:220
2 陈嘉薇,杜金荣,陈淑范.rDNA转录活性分析、检测恶性肿瘤的新途径.哈尔滨医科大学学报,1996;30:307
3 陈立奇,何其华,刘 奇,等.带腹水癌肉瘤S-180小鼠的骨髓淋巴细胞 rDNA转录活性变化的研究.动物学报,1994;40:218
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